黄花蒿青蒿素研究进展

龙金花，熊 硕，刘硕谦，肖文军

（湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

青蒿素是一种含有过氧基团的倍半萜内酯新型抗疟药物，主要从我国菊科艾属植物黄花蒿（Artem isia annua L.）提取而来。青蒿素类药物因其具有高效、低毒、强抗疟性等特点，被WHO 批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物[1-2]。我国青蒿素产业有着重要的国际影响力，商品化的青蒿素均是从我国的黄花蒿植物中提取获得，但由于黄花蒿中青蒿素含量低，生产成本非常高，导致青蒿素类产品的价格超出了发展中国家疟疾患者的承受能力，严重影响了青蒿素在抗疟疾方面的应用。笔者从黄花蒿资源的优选和改良、促进青蒿素积累的栽培技术、青蒿素提制技术、质量安全控制技术以及青蒿素功能与产品开发等方面，综述了黄花蒿青蒿素研究进展，以期为黄花蒿青蒿素高效开发利用提供参考。

1 黄花蒿资源的优选与改良

1.1 资源优选

目前栽培的黄花蒿基本由野生黄花蒿直接引种，而青蒿素在野生黄花蒿中的含量很低（0.1%～1%），因此选育优良品种对青蒿素的高产栽培具有重要意义。向极钎等[3]采用派生系统法和集团混合法对青蒿植株类型进行定向筛选，选育出平均产量为4 226.7 kg/hm2，青蒿素含量为1.071%的鄂青蒿1 号。李隆云等[4]利用母系系统选育和混合选择制种相结合的选育方法选育出青蒿素质量分数在1.0%以上的青蒿新品种“渝青1 号”。马进等[5]选育出了青蒿素含量高达1.945%的株系。通过传统选育育成的高含量青蒿素单株其优良性状不能稳定遗传，后代性状分离，表现多样化，需要极大的工作量和时间。

1.2 资源改良

近年来青蒿素生物合成途径的研究及其合成关建酶基因的发现，为青蒿素生物合成途径遗传改造奠定了基础。陈韵裴等[6]通过过量表达DXR 基因将青蒿中青蒿素的含量最高提高了2.84 倍；王亚雄等[7]过表达HDR 基因和ADS 基因使青蒿素含量最高达到非转基因对照的3.48 倍。Zhang 等[8]利用RNAi 技术抑制鲨烯合酶基因SQS 的表达，使青蒿素最高量可达31.4 mg/g。通过遗传改良的方法能快速获得高青蒿素含量的黄花蒿植株。

2 黄花蒿栽培技术的优化

黄花蒿中青蒿素的含量与外界环境有关，适时播种、加强田间管理及合理采收有利于获得高青蒿素含量的黄花蒿。Kumar 等[9]在不同温度下对黄花蒿进行了发芽试验，结果表明，选择气温连续7 d 在15～20 ℃作为播种期时，此时黄花蒿的发芽率最高。肖文中等[10]对不同栽培模式下青蒿素的含量进行了比较，认为高畦盖膜栽培模式有利于青蒿素含量的提高。王满莲等[11]发现黄花蒿对种植密度和养分条件变化的适应性较强，低密度、低施肥水平时黄花蒿中青蒿素的含量最高，以种植密度55 555 株/hm2、施肥水平60 kg/hm2为宜。何军[12]发现经一定浓度水杨酸和脱落酸处理的黄花蒿中青蒿素含量能有效提高。秦艺[13]研究表明某些菌根真菌能明显促进青蒿素含量的积累。钟凤林等[14]对黄花蒿最佳采收条件进行了探索，认为青蒿的最佳采收期应为生长盛期至花（蕾）期之前，此时青蒿素含量高，营养体重量大；采集青蒿样品应选择在采收期的晴天中午12:00～16:00 为宜；为保证用药质量，产地加工青蒿时以晒干为最好。

3 青蒿素提制技术

青蒿素是从黄花蒿中提取的一种无色针状晶体，分子式为C12H22O5，相对分子质量为282.33，溶点为156～157 ℃，易溶于丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯及冰醋酸，可溶于乙醇和甲醇、乙醚、石油醚，几乎不溶于水，因其具有特殊的过氧基团，所以对热不稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解[15]。

青蒿素的提制工艺一般为：干燥→破碎→浸泡、萃取（反复进行）→浓缩提取液→粗品→结晶→精品。王轶[16]以青蒿叶干粉为原料进行室温提取，青蒿素提取率高达78.19%。李自勇等[17]采用工业酒精冷浸法提取青蒿素，得到的青蒿素产品产率可达2.73‰，纯度可达99%。张馨莹[18]采用以石油醚提取为提取剂的加热搅拌提取法，测得青蒿素的提取率为9.452 mg/g。近年来有不少新技术被应用到青蒿素的提取分离中，如超临界CO2技术[19]、智能连续逆流提取法[20]、超声提取法[21]等。因生产成本与技术等问题，目前工业提取青蒿素多采用有机溶剂萃取法，以乙醇作为提取剂，分离纯化时将提取液浓缩成浸膏，浸膏溶解后上活性炭柱色谱柱，洗脱，收集流份[22]，或采用硅胶柱层析法等[23]进行分离纯化。再经结晶、干燥即可制成精品。

4 青蒿素质量安全控制技术

4.1 青蒿素分析检测技术

陈迪钊等[24]采用紫外分光光度法对青蒿素含量进行了分析，相对标准偏差RSD=1.84%，相关系数r=0.999 5，回收率为98%～102%。陈益元等[25]用高效液相色谱法测定经无水乙醇提取的青蒿素，在青蒿素浓度为5.0～25.0mg/L 范围时，线性相关系数r=0.9998，青蒿素的含量在0.554%～1.020%之间。除以上两种常用的检测方法之外，青蒿素的测定方法还有红外光谱法[26]、高效毛细管电泳法[27]等。

4.2 质量安全控制技术

青蒿素安全控制技术包括农药残留、重金属超标和溶剂残留的控制。在黄花蒿规模化种植中，各类型农药的使用不可避免。根据国家标准常用农药残留有六六六（BHC）≤0.1 mg/kg、滴滴涕（DDT）≤0.1 mg/kg、五氯硝基苯（PCNB）≤0.1 mg/kg、艾氏剂≤0.02 mg/kg等。虽然目前在黄花蒿原料中较少发现重金属含量超标的现象，但重金属超标的问题不能忽视。重金属国家限量指标为铅（Pb）≤2.49 mg/kg、镉（Cd）≤0.2 mg/kg、砷（As）≤0.6 mg/kg、汞（Hg）≤0.2 mg/kg、铜（Cu）≤18.2 mg/kg。这些农药残留和超标重金属含量低但对人体危害大，严重能致癌和造成死亡。青蒿素的提制多采用乙醇提取，也有使用乙醇进行制粒，因此乙醇为主要残留溶剂。乙醇为三类溶剂，根据《中国药典》和国际协调会议（ICH）相关指导原则的要求，其限度为0.5%。

在原料中农药残留检测方法的相关研究上，陈燕[28]建立了黄花蒿氨基甲酸酯类农药的高效液相色谱分析方法，吴晓波[29]建立了GC-MS-SIM 和GC-MS-MS多残留检测方法，还有免疫分析法[30]等。在重金属残留检测方法的相关研究上，张春盛等[31]采用分光光度法测定了8种中药材的重金属含量。蔡丽君[32]研究了重金属含量的分子光谱检测方法。高红霞等[33]采用单一硝酸对样品进行微波消解后，用电感藕合等离子体质谱仪同时对10种元素进行了测定。溶剂残留的检测多采用液固顶空气相色谱法，如木书林等[34]用液固顶空气相色谱法测定了双氢青蒿素哌喹片中乙醇的残留含量，孙红英等[35]采用毛细管GC 法测定了青蒿琥酯中有机溶剂的残留量等。

5 青蒿素的功能与产品开发

青蒿素及其衍生物是目前广泛应用的一线抗疟药。青蒿素类药物主要有双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等；复方制剂主要有复方萘酚喹片、双氢青蒿素哌喹片、复方蒿甲醚等[36]。

黄花蒿在中医上具有清热凉血、解暑、除蒸、益气、凉血利尿的功效。除强大的抗疟能力外，青蒿素及其衍生物还能杀灭多种寄生虫如疟原虫、血吸虫、弓形虫、利什曼原虫，能调节免疫，可用于治疗红斑狼疮和类风湿性关节炎[37]。此外，还具有抗孕、抗纤维化、抗心律失常和肿瘤细胞毒性等药理作用[38]。青蒿素及其衍生物应用广泛，现已开发了大量的药物和产品，如用于治疗红斑狼疮的双氢青蒿素控释剂[39]、治疗类风湿性关节炎和免疫性疾病的含青蒿提取物药物组合物[40]、治疗急性髓细胞性白血病的青蒿素衍生物及其药用盐[41]、治疗慢性支气管炎的药物组合青蒿油滴丸[42]等。此外还有青蒿饲料添加剂[43]、天然青蒿茶[44]、青蒿抑菌沐浴露[45]等。

6 讨 论

青蒿素产业的发展需要各方面共同促进。通过遗传改造快速获得高青蒿素含量的植株将是高产黄花蒿育种的主要方向；土壤中肥料的多少对青蒿素含量的影响不大，但外界环境的刺激能显著改变青蒿素含量，特定条件下青蒿素含量的变化将是黄花蒿高产栽培技术的重要研究方向；由于青蒿素在黄花蒿中含量很低，在提取青蒿素时大量废料的产生不可避免，这也是青蒿素生产成本一直较高的原因之一，对废料的再利用将有利于节约生产成本；青蒿素的质量控制要从源头开始，黄花蒿的栽培地应选择在土壤与周边环境良好的地区，并加强田间管理，多施用有机肥改善土壤条件，选择绿色生物农药，而溶剂残留问题可以通过优化现有工艺、严格规范生产或使用新型技术进行控制。

青蒿素产业的发展也离不开相关功能和产品的研究开发。结合市场需求，青蒿素低成本生产及其新功能的挖掘与利用将是黄花蒿青蒿素开发利用的发展趋势。

青蒿素在黄花蒿中含量很低，在人工大规模化学合成还无法实现的情况下，使得青蒿素的开发利用受到极大限制。虽然采用工程菌辅助发酵完成青蒿素体外生物合成是一个有效解决原料难题的方法，但要达到一步式直接生物合成青蒿素，还需要更多的探索。由于青蒿素的天然产物提取生产成本很高，能否从根本上解决原料中青蒿素含量低的问题，已经成为制约我国青蒿素天然产物提取行业发展的重要瓶颈。由此可见，选育高青蒿素含量的优良品种至关重要。相对于传统育种方法后代遗传性状不稳定、育种所需年限长、工作量大的缺点，基因工程育种能定向进行遗传改造，大大缩短育种年限，且效果明显。青蒿素的生物合成是一系列复杂的反应过程，有多种中间产物和多条分支途径，这也是青蒿素生物产量低的根本原因。要促进青蒿素的积累，“开源”与“截流”是两大重要策略。通过过表达技术促进主干流的积累与反义RNA技术抑制支流的消耗来共同促进青蒿素的生物合成，最终获得高青蒿素含量的黄花蒿植株是目前也是将来研究的热点。

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