SPINK1/Spink3 的研究进展

张 婧，王 军

(1.大连医科大学 研究生院，辽宁 大连116044;2.大连医科大学 病理生理学教研室，辽宁 大连116044)

丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1 型(serine protease inhibitor Kazal type 1，SPINK1)属SPINK 家族，SPINK 家族成员在机体的诸多生理和病理过程中起到了重要的作用，参与了多种炎症和肿瘤的发生发展且与多种人类疾病有关［1］。

SPINK1 由人的胰腺腺泡细胞分泌合成，丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 3 型(serine protease inhibitor Kazal type 3，spink3)是SPINK1 的小鼠同源基因，SPINK1/Spink3 同时也被称为胰腺分泌性胰酶抑制因子(pancreatic secretory trypsin inhibitor，PSTI)和肿瘤相关性胰酶抑制因子(tumor associated trypsin inhibitor，TATI)［2-3］。近些年来，SPINK1/Spink3 的基因突变，其与自噬、表皮生长因子、胰腺炎的发病机制、肿瘤的发生和预后的关系，以及其信号传导通路等方面的研究出现了很多新的报道，提示SPINK1/Spink3 不但是胰蛋白酶的抑制因子，而且还具有生长因子和自噬的负调节因子的生物学特性［2-5］，在机体内的诸多生理功能和病理状态下起到了重要作用，本文就近年来对SPINK1/Spink3 最新的研究进展进行简要阐述。

1 SPINK1 与基因突变

1.1 基因突变

SPINK1 基因(包括内含子、外显子和信号多肽)突变和SPINK1 启动子变异［6］可能引起其功能丧失或增强，也有可能不产生任何影响。启动子c.87 +1G ＞A 的剪接变异会引起SPINK1 功能的丧失［7］;基因内IVS3 +2T ＞C 突变会影响外显子3 的剪接从而起功能丧失［8］;SPINK1 多肽中三个信号肽的变异和15 个错义突变(但不包括Q68R、S10N、N37S、L12F、N34S 和P55S)会引起SPINK1 不表达［9-12］;Q68R 突变会增加SPINK1 表达［11］，但其是引起功能增加还是功能丧失仍须进一步研究。目前，最常见的是外显子3 的101A ＞G 的改变，此改变导致了SPINK1 基因N34S 突变［13］。

1.2 SPINK1 基因突变与胰腺炎的关系

在胰腺组织中，SPINK1 被认为是抑制胰蛋白酶原激活的“第一道防线”，其能抑制总胰蛋白酶20%的活性，当SPINK1 的抑制能力减弱时，可能会导致胰腺炎的发生［3］;也有人认为SPINK1 在维持胰腺腺泡细胞的完整性和再生能力的过程中起着重要的作用，所以SPINK1 的基因突变可能会导致其功能减退或丧失，这可能是胰腺炎发生发展过程中的一个重要的危险因素［2-3，14-15］。

Aoun 等发现SPINK1 -N34S 点突变并不提高急性胰腺炎首次发病的概率，但SPINK1 -N34S 点突变的患者比SPINK1 基因正常的患者发生急性胰腺炎反复发作的概率高出19 倍，所以在急性胰腺炎首次发作时就鉴别出SPINK1 -N34S 点突变可以有效的预防急性胰腺炎的反复发作和其向慢性胰腺炎的转化［16-18］。而在印度的急性胰腺炎患者调查中发现，SPINK1 -N34S 点突变较为常见，且与较早的发病年龄有关，这表明SPINK1 -N34S 点突变可能降低了急性胰腺炎发病时间的阈值［19］。最近，Gao等［20］发现传统的中医治疗可以通过降低SPINK1 和PRSS1 的表达来达到减轻急性胰腺炎症状的目的。

在慢性胰腺炎患者中，约有5.4%的患者发生SPINK1 -N34S 突变，且白种人发生SPINK1 -N34S突变的比例更高。SPINK1 -N34S 突变可能导致特发性胰腺炎发病时间提前，且频繁的胰腺炎发作最终可导致胰腺功能不全。所以，Sandhu 等［21］认为患有特发性胰腺炎且伴饮酒史的病人应该做SPINK1基因突变的检测。事实上，Cichoz -Lach 等［22］在比较了慢性酒精性胰腺炎、慢性非酒精性胰腺炎和正常对照组的基因后发现，SPINK1 -N34S 基因突变可能与慢性酒精性胰腺炎有密切的关系。

SPINK1 -P55S 在健康人群和胰腺炎患者中的突变发生率分别为0.5%～3%和0.9%～7.3%，这表明SPINK1 -P55S 突变可能与胰腺疾病有关［23］。但同时也有人认为D50E、Y54H、R67C 突变导致SPINK1 蛋白错误折叠使其分泌减少或不分泌，从而增加了胰腺炎发生的危险性［23］。

2 SPINK1/Spink3 与自噬

2.1 自 噬

自噬常被称作“细胞管家”，其不仅可以清除细胞内的堆积物质和损伤物质，还可以构建一个细胞内物质和体内平衡的动态循环系统;此外自噬还参与细胞分化，组织重建，生长抑制和细胞对外环境的适应与防御等多种生理功能的过程［24］。

2.2 SPINK1/Spink3 胰腺自噬负调节因子

Ohmuraya 等［25］发现胰腺腺泡细胞的Spink3 基因敲除(Spink3-/-)小鼠，其胰腺组织会发生明显的自噬作用。Spink3-/-小鼠与正常的小鼠相比较，Spink3-/--/-小鼠出生后出现严重的发育迟缓、胰腺逐渐萎缩消失、脾脏较小。在Spink3-/-小鼠的胰腺腺泡细胞中检测到高表达的自噬体(LC3 -Ⅱ)，且在电子显微镜下观察到Spink3-/-的GFP -LC3小鼠的胰腺腺泡细胞的胞浆中出现了许多荧光点，在排除了凋亡和坏死的因素后，确认小鼠的胰腺腺泡细胞发了生明显的自噬现象，这表明SPINK1/Spink3 对抑制自噬和对保持胰腺腺泡细胞的完整性及再生性起着重要的作用。

同样，Chera 等［26］报道对水蛭行基因沉默的结果提示，丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal Ι 基因是防止水蛭过度自噬和截肢后行使细胞保护功能所必需的。

2.3 SPINK1/Spink3 作为自噬负调节因子与急性胰腺炎的关系

很久以来，急性胰腺炎被认为是胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原不恰当的激活所致，但是最新的研究表明自噬与急性胰腺炎之间具有一定的联系［27］。Hashimoto 等［27］在蛙皮素诱导的急性胰腺炎模型中发现，随着急性胰腺炎严重程度的增加，经检测LC3 -Ⅱ/LC3 -I 比例增大(LC3 -I 蛋白位于细胞质并可以转化为LC3 -Ⅱ，而LC3 -II 是自噬体膜中的磷脂酰乙醇胺共轭的一种形式，所以LC3 -II/LC3 -Ⅰ比值与自噬体的数量成正相关)，且电子显微镜下观察到的LC3 的绿色蛋白荧光点也随之增多，这证实了自噬与小鼠急性胰腺炎的发病有关［27］。同时，Hashimoto 等［27］在另一个胰腺腺泡细胞Atg5 基因(Atg5 基因是自噬体形成的重要基因)敲除的小鼠模型的实验中发现，注射蛙皮素后，除了轻微水肿外，既没有发现胰蛋白酶原被激活，也没有观察到腺泡细胞严重变性、结缔组织水肿、炎性细胞浸润等急性胰腺炎发作的病理征象。这一结果提示，急性胰腺炎的发生可能由过度自噬诱导。因此，SPINK1/Spink3 对胰腺可能具有双重保护作用，一是作为胰蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶的活性，二是通过自噬的负调节来抑制胰蛋白酶原的激活，从而阻止急性胰腺炎的发生［27］。

同时，也有学者认为胰腺腺泡细胞内的自噬通量受损是导致腺泡细胞的空泡形成和胰蛋白酶原激活的主要原因。Mareninova 等［28］发现在啮齿类动物的急性胰腺炎模型中，介导胰腺腺泡细胞空泡形成的自噬通量受损，组织蛋白酶L (CatL)和组织蛋白酶B(CatB)之间的加工能力平衡失调，导致溶酶体降解功能缺陷，使自噬发展过程迟缓。

2.4 SPINK1/Spink3 作为自噬负调节因子的信号传导通路

因SPINK1/Spink3 与EGF 的结构相似且能与EGFR 结合，研究者推测SPINK1/Spink3 作为自噬的负调节因子可能通过激活EGFR 信号传导通路行使其作用［29］。但是在特定性胰腺腺泡细胞EGFR缺失(EGFR-/-)的小鼠中，并未发现胰腺发育异常，也未发现腺泡细胞出现自噬现象;而且在EGFR-/-小鼠蛙皮素诱导的急性胰腺炎模型中，也未发现胰腺腺泡细胞出现自噬现象;同时Her2 和Her3 蛋白表达与对照相比无明显变化，提示ERBB家族的其他成员未参与EGFR-/-缺失可能产生自噬后的代偿机制，上述结果表明SPINK1/Spink3 作为自噬负调节因子的信号传导独立于EGFR 信号传导通路，且很有可能存在其他的信号传导途径［30］。

3 SPINK1/Spink3 与表皮生长因子

3.1 SPINK1/Spink3 与表皮生长因子在结构和功能上的关系

现已证实，SPINK1/Spink3 与表皮生长因子(EGF)在结构上约有50%的同源相似性，二者的氨基酸残基的数目相似，分子量均约为6kDa［3，23，29］，且SPINK1/Spink3 可以促进多种细胞系的增长，有人认为其在某些细胞中可能起生长因子的作用［23，29］。

Ozaki 等［29］发现SPINK1 可促进NIH3T3 成纤维细胞和人胰腺癌细胞增生，并与表皮生长因子受体(EGER)结合，且SPINK1 与EGFR 结合的亲和力是EGF 的一半，在添加EGFR 抑制剂AG1478 后，EGF 和SPINK1 促进AsPC-1 细胞增生的能力完全被抑制;另有报道发现SPINK1/Spink3 可增强溃疡后细胞再生和上皮细胞的迁移过程，且这种迁移可被EGFR 抗体所抑制［3］。

但是SPINK1/Spink3 受体的确定一直存在争议，有人认为PSTI 与分子量为140kD 的细胞膜多肽相关联，而此分子量明显区别于EGFR［3］。

3.2 SPINK1/Spink3 作为生长因子的信号传导通路

SPINK1/Spink3 与EGF 结构相似［3］，且可促使某些细胞系增生，这种增生作用可能是通过SPINK1/Spink3 与EGFR 结合，启动EGFR 信号传导通路，从而激活其下游信号传导分子完成的［29］。Ozaki 等人发现SPINK1/Spink3 和EGF 可促使MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT 信号传导通路下游靶分子磷酸化，促进细胞增生，其中MAPK/ERK 激酶抑制剂U0126 可完全阻断胰腺肿瘤细胞增生，所以MAPK 信号传导通路可能起主要作用［3，29］。同时，Ateeq 等人发现在前列腺癌细胞中SPINK1 能与EGFR 结合，且抑制SPINK1 会减弱EGFR 信号通路所介导的下游通路，但他们发现SPINK1 作为生长因子的促癌作用存在EGFR 依赖性和EGFR 非依赖性两条途径，提示SPINK1 在细胞膜表面或胞浆中可能存在着不同的受体［23，31］。

4 SPINK1/Spink3 作为肿瘤相关性胰酶抑制因子(TATI)与肿瘤

4.1 TATI 与多种肿瘤之间的关系

自1982年Stenman 等［32］在一名卵巢癌患者的尿液中发现了TATI 后，TATI 在肿瘤中的表达得以广泛研究。目前有数据显示，体外培养的前列腺癌、十二指肠癌、结肠癌和胆囊癌细胞均向培养基中分泌TATI［6，33-34］;血清中TATI 高表达是不良预后的标志［23］，在部分研究中发现TATI 的高表达与前列腺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、上皮卵巢癌、肺癌和雌激素受体阳性乳腺癌的不良预后有关［35-37］，特别是TATI 可用于鉴别是否发生结肠癌的肝转移［38］;血清中的TATI 可作为癌症诊断的标记物［23，39-40］，与其它血清肿瘤标记物相比，TATI 在诊断胰腺癌、卵巢癌、食管癌和膀胱癌时，其诊断效果更加明显［23］。

Ateeq 等［31］已经证明TATI 的过表达是前列腺癌的致癌原因之一，TATI 可以通过自分泌和旁分泌信号促进前列腺癌细胞的增殖和侵袭，且其在体内可以促进前列腺癌的血管內渗作用和异种移植肿瘤的生长;并提出可通过TATI 的RNA 干扰和封闭抗体来治疗前列腺癌。Lippolis 等［35］最近发现在前列腺癌中，ERG(一种癌蛋白)和TATI 不能在相同的癌症细胞中共同表达，二者只能表达其中之一，所以对于接受根治性前列腺切除术治疗的患者来说，ERG 或TATI 都不是一个有用的预测指标;Lippolis认为可将ERG 和TATI 结合来消除肿瘤细胞内的基因融合和肿瘤相关抗原，以达到治疗前列腺癌的目的。

膀胱癌患者血清中的TATI 浓度可用来判断对化疗的反应［23］;但是在接受根治性膀胱癌切除术的膀胱移行细胞癌的患者中约有超过一半的患者的血清中不表达TATI，尽管此时TATI 已经不是一个独立的预后指标，但其仍可做为肿瘤分期的生物标志物来辅助临床的决策［41］。

在乳腺癌中，TATI 不但可抑制乳腺癌细胞凋亡，影响其生存、侵袭、转移能力，而且还可通过降低caspase 3 和提高bcl2 的水平对多种抗肿瘤药物产生耐药性［36］，影响化疗的效果，但TATI 的作用可以被中和抗体抑制，因此有人提出这可能会是一个潜在的治疗靶点［23，42］。

Koskensalo 等［43］第一次在大肠癌中发现EGFR与TATI 的联合表达是一个独立的预后良好的指标，EGFR 与TATI 的联合表达作为检测大肠癌预后效果更佳，但其机制仍需进一步研究。

也有人担心TATI 可以抑制胰蛋白酶原过早的激活来抑制胰腺炎的发生，如果人为地干扰这种机制，则可能会增加胰腺炎发生的危险性［44］。不过，TATI 做为癌症治疗的潜在治疗靶点，很可能会成为未来癌症治疗的热点。

4.2 TATI 的信号传导通路

在肿瘤中TATI 高表达与其较差预后之间的关系，可用TATI 作为生长因子发挥作用来解释［29，31］，所以TATI 可能通过EGFR 信号传导通路引起肿瘤的侵袭作用［33，45］。最近，Wang 等［46］在前列腺癌中发现，SPINK1(TATI)可以通过EGFR 信号传导通路(包括MAPK、MEK、ERK 途径)来促进间质转化(EMT)，且可作为体内新的预后标志物;同时Chen等［47］在大肠癌的研究中发现SPINK1 蛋白可能通过EGFR 信号传导通路在肿瘤的增殖和恶性转化方面起着重要的作用。

5 结语与展望

越来越多的研究者在研究SPINK1/Spink3 多重的生物学特性，并致力于更清楚地阐明其中的机制。但是，笔者认为目前仍存在一些问题亟待解决:SPINK1/Spink3 的突变与各种类型的胰腺炎之间是否存在必然的联系;SPINK1/Spink3 除了作为生长因子与EGFR 相结合发挥作用外，是否存在其他机制;SPINK1/Spink3 作为自噬的的负调节因子，与其在部分类型肿瘤内高度表达有无重要联系，它们的分子信号传导通路有无关联;SPINK1/Spink3 在很多类型肿瘤内高度表达，其在肿瘤发生发展的过程中是如何作用的，且其主要机制和分子信号传导通路是怎样的。

随着研究的深入，人们会更清楚地认识到SPINK1/Spink3 与胰腺炎及胰腺癌之间的联系，为胰腺疾病的预防和治疗提供一个新的思路;SPINK1/Spink3 作为某些肿瘤诊断和预后评估的标志物，会为肿瘤的病情监测和临床靶向治疗提供一个新的方向。

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