大连地区耳聋人群常见聋病基因突变的研究

牟书瑜，刘 琳，崔 玲，赵黎阳，柏 桦，别 旭，孙秀珍

(1.大连市友谊医院 耳鼻咽喉科，辽宁 大连 116001; 2.大连医科大学 附属第二医院 耳鼻咽喉科，辽宁 大连 116027)

大连地区耳聋人群常见聋病基因突变的研究

牟书瑜1，刘 琳1，崔 玲1，赵黎阳1，柏 桦1，别 旭2，孙秀珍2

(1.大连市友谊医院 耳鼻咽喉科，辽宁 大连 116001; 2.大连医科大学 附属第二医院 耳鼻咽喉科，辽宁 大连 116027)

目的 筛查分析大连地区耳聋人群中4个耳聋基因的9个位点的突变携带及分布状况，以探讨大连地区耳聋患者常见聋病基因突变特点及发病率。方法 采用基因芯片检测5 266例耳聋患者4个聋病基因中常见的9个位点：GJB2基因的35delG、176del16、235delC和299delAT，SLC26A4基因的2168A>G和IVS7-2A>G，线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA基因的1555A>G和1494C>T，GJB3基因的538C>T。采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。结果 大连地区5 266例耳聋人群中，发现携带遗传性耳聋相关突变基因的患者1 416例(26.89%，1 416/5 246)，其中GJB2基因突变携带者657例(12.48%，657/5 266)，SLC26A4基因突变携带者512例(9.72%，512/5 266)，mtDNA 12S rRNA线粒体基因突变携带者239例(4.54%，239/5 266)，GJB3基因突变携带者8例(0.15%，8/5 266)。结论 应用基因芯片可以高效、快速地在大样本人群中，尤其是聋人群体中进行大规模的基因筛查；大连地区耳聋人群携带遗传性耳聋相关突变基因的发生率均较低。

耳聋;基因芯片;筛查; GJB2;SLC26A4;mtDNA12SrRNA;GJB3

无论是先天性还是迟发性的听力下降，都有一定的遗传因素作用，聋病基因芯片的研制成功，为进一步了解耳聋的本质提供了方便。北京博奥生物有限公司研制的聋病基因芯片[1]可一次性检出GJB2、PDS、GJB3和线粒体共4个基因9个位点的突变情况。本研究应用该系统对大连市耳聋残疾人群进行检测，以了解常见聋病基因在大连地区耳聋人群中的分布，对部分人群给出基因诊断，并在婚育方面给予指导，以避免再生或降低其后代发生遗传性耳聋的几率。

1 资料与方法

1.1 研究对象

来源于大连市残疾人联合会的持证听力残疾患者5 266例，其中男2 899 例，女2 367例，年龄最小1岁，最大90岁，平均(42.51±17.60)岁，所有患者均为持有大连市颁发的听障残疾证，一至四级，均来自大连市各区及县，所有患者均在医生指导下填写“耳聋病人信息登记”，获取耳聋相关信息，包括一般信息、耳聋发病年龄、家族史、个人史(包括耳聋前传染病史、耳毒性药物应用史、外伤史等)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因检测内容：所有受检者均接受了常见聋病基因检测，包括：GJB2基因的35delG、176del16、235delC和299delAT，GJB3基因的538C>T，线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA基因的1555A>G和1494C>T，SLC26A4基因的2168A>G和IVS7-2A>G。

1.2.2 DNA制备方法：用含有EDTA抗凝剂的采血管采集受检者3 mL外周静脉血，应用康为世纪 CW0544 血液基因组非柱式提取试剂盒提取人全血基因组，提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。-20 ℃保存并在1个月内完成基因检测。

1.2.3 基因芯片检测：(1)PCR 扩增：在模板加样区内，向相对应的 A、B 系列试剂中分别加入 3 μL同一样本核酸溶液，按照遗传性聋病基因检测 PCR 扩增程序进行 PCR 扩增；将离心管或八连排管置于 PCR 扩增仪中，按晶芯®E-CyclerTM 96 PCR 仪标准操作规程进行 PCR 扩增反应；总反应时间约为 3 小时 20 分。(2)芯片杂交：按照晶芯®BioMixer II 芯片杂交仪标准操作规程设定杂交程序。(3)扫描判读：使用晶芯®LuxScan TM 10K/B 微阵列芯片扫描仪和晶芯®9项遗传性耳聋基因检测芯片判别系统进行信号的读取及结果判断。本方法检测对象为遗传性耳聋相关基因突变位点，共计 9 个。

2 结 果

5 266例耳聋患者中，发现携带遗传性耳聋相关突变基因的患者1 416例(26.89%，1 416/5 266)，其中GJB2基因突变携带者657例(12.48%，657/5 266)，SLC26A4基因突变携带者512例(9.72%，512/5 266)，mtDNA 12S rRNA线粒体基因突变携带者239例(4.54%，239/5 266)，GJB3基因突变携带者8例(0.15%，8/5 266)。

3 讨 论

耳聋是一种很普遍的感音神经功能紊乱，受到社会和经济的影响。在世界范围内，先天性耳聋的患病率大概为1～3/1 000，包括已知的许多由遗传和环境引起的耳聋，在中国每年有30 000个患有先天性听力损害的婴儿出生，在语前聋患者中，60%的患者是遗传性耳聋。目前已知的非综合征性耳聋突变位点已经有133个，克隆的基因达40多个，博奥生物有限公司研制的耳聋基因芯片涵盖部分临床常见的耳聋基因，用于大样本基因筛查有较大的实用意义。

3.1 GJB2基因

GJB2基因定位于13q11-12,全长4 804 bp，编码区为678 bp，编码在耳蜗和表皮中表达的β类缝隙连接蛋白Connexin26(Cx26)。Cx26是一种跨膜蛋白，与其他的连接蛋白分子形成连接子，连接子在毗邻的细胞融合形成间隙连接，这个大孔允许细胞质交换电解质、第二信使和代谢物。

GJB2基因异常是遗传性非综合征性耳聋的主要致病原因。目前已有111种突变方式被报道[2]，其中显性突变9种，隐性突变92种，未知突变10种。GJB2突变后引起的NSHL具有明显的种族差异性[3]，且突变复杂多样，欧美人群中Cx26基因突变最多见为30delG或35delG的热点突变，在地中海国家和美国遗传性无综合征耳聋患者中占60%～85%，而在中国人群中尚未发现。戴朴等[4]对中国18个省份聋校的1 680例非综合征性耳聋病例GJB2基因检测中发现235delC突变的检出率较高，为18.16%。本研究中，在耳聋人群中GJB2基因检出率为12.48%(657/5 266)，以235delC检出率最高，仍未发现35delG的基因突变。

3.2 SLC26A4基因

SLC26A4基因又称PDS基因，位于人类染色体7q31，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，是一种跨膜蛋白。SLC26A4基因某一位点的突变导致Pendrin功能障碍，引起CI-转运障碍或内耳淋巴液流动异常，引起前庭导水管扩大(enlarged vestibular aqueduct，EVA)和内淋巴管内压升高，内耳毛细胞受损和听神经萎缩，从而导致听力下降。

目前报道的SLC26A4基因突变类型已达160种[5]，不同种族的人群中SLC26A4基因突变谱不同，在北欧最常见的突变是L236P、T416P和IVS8+1 G > A；在东亚IVS7-2A>G和H723R是韩国人、中国人和日本人突变频率较高的类型。赵亚丽等[6]在明确诊断前庭水管扩大的耳聋患者研究中发现IVS7-2A>G在所有突变体中约占57.63%(102/177)，本次研究中SLC26A4基因突变发生率为(9.72%，512/5 266)。

大前庭水管是儿童感音神经性耳聋最常见的内耳畸形，患儿出生时可能听力正常，或伴有轻度至中重度的听力损失，患儿如语前发病者，多有较好的语言能力， 发病之前有感冒，颅外伤或其他使颅压增高的病史，可以造成明显的听力下降，约81%～94%的患者为双侧发病。临床表现为波动性感音神经性听力损失，多呈进行性、高频听力下降，无低频下降的上升型听力曲线。对LVAS的突变基因筛查，有利于LVAS的早期诊断，从而指导携带致病基因的儿童行为，预防疾病发生。

3.3 线粒体DNA(mtDNA)

线粒体DNA(mtDNA)是唯一存在于人细胞质中的DNA分子，是独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码的功能，但同时核DNA的调控，在有性生殖中，受精卵的线粒体绝大部分来自于卵子的细胞质，这一特点决定了线粒体遗传属于母系遗传。mtDNA的突变可通过母亲传给后代，后代子女中的女性可将突变的mtDNA继续传给下一代，而男性不再下传。这一特点也成为预防mtDNA突变携带者发生药物性耳聋的关键。

不同国家及不同人种mtDNA突变的发生率不尽相同，高加索人种突变频率为0%～28.57%，日本非综合征SNHL中A1555G突变频率为3%～8.7%，纪育斌等[7]综合16篇研究对象为非综合征型SNHL患者的文献数据，初步得出中国的非综合征型SNHL患者中A1555G突变频率为6.62%(230/3 473)。本研究中发现mtDNA 12S rRNA在大样本耳聋人群中突变频率为4.54%(239/5 266)，由于种族和环境及地域的差异，发病率也因而有较大的不同。

本次研究中mtDNA突变239例中有110例有明确氨基糖甙类抗生素用药后致聋史。有97例发病年龄>5岁，语言能力尚好，表现为迟发性听力下降，提示遗传因素可能在该类基因携带者耳聋发病中起重要作用。此次筛查发现有239例携带药物易感耳聋基因突变。根据该基因的母系遗传规律，其母系家族成员中还有10倍成员，约2 390人携带此类致聋基因。如果他们不慎使用氨基糖苷类药物后必将导致听力损害和听力下降。通过对他们整个母系家族用药指导，将有效地预防和避免他们发生听力残疾。

3.4 GJB3基因

GJB3基因，即编码Cx31的基因，可以引起常染色体显性或者隐性遗传性非综合征型耳聋。1998年Xia JH等[8]最早报道了两个引起显性遗传高频听力下降的GJB3突变。在中国各地研究中发现GJB3基因突变的发生率不高，0.56%(1/87)[9]、0.75%(1/133)[10]或更低，本研究中为0.15%(8/5266)。

与国内同类研究相比，本研究发现耳聋人群携带遗传性耳聋相关突变基因的发生率均较低，主要原因为本研究年龄范围不同于其他研究，包含了老年聋群体和其他原因致聋的病人。但本次研究遵循随机化原则，随机选择耳聋人群，并且样本量较大，对国内进行遗传性耳聋基因检测的流行病学研究具有重要意义。

[1] 王国建，戴朴，韩东一，等.基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究[J].中华耳科杂志，2008,6(1)：61-64.

[2] Kenneson A, Van Naarden Braun K, Boyle C. GJB2 (connexin 26) variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: a HuGE review[J]. Genet Med， 2002,4 (4): 258-274.

[3] A Cryns K,Orzan E,Murgia A,et al.A genotype-phenotype correlation for GJB2 (connexin 26) deafness[J]. J Med Gene， 2004,41(3):147-154.

[4] 戴朴,于飞,刘新，等. 18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究I-GJB2 235de1C和线粒体mtDNA 12S rRNA A1555G突变筛查报告[J].中华耳科学杂志，2006,4(1):1-5.

[5] Pera A, Dossena S, Rodighiero S,et al.Functional assessment of allelic variants in the SLC26A4 gene involved in Pendred syndrome and nonsyndromic EVA[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2008,105(47):18608-18613.

[6] 赵亚丽，王秋菊，李庆忠，等. 95例前庭水管扩大核心家系SLC26A4基因特异突变图谱[J]. 听力学及言语疾病杂志，2008,16(3):171-177.

[7] 纪育斌，王秋菊，兰兰，等.国内线粒体DNA 12S rRNA A1555G 突变的流行病学文献分析[J]. 听力学及言语疾病杂志，2010，18(1):6-10.

[8] Xia JH,Liu CY,Tang BS,et al.Mutations in the gene encoding gap junction protain beta-3 associated with autosomal domination hearing impairment[J].Nat Genet, 1998,20(4)：370-373.

[9] 梁爽,孙喜斌,韩睿，等.非综合征型聋患者耳聋相关基因检测结果分析[J].听力学及言语疾病杂志，2011，19(1):10-13.

[10] 陈俞,玛依拉·吐地,张华，等.新疆维吾尔族与汉族非综合征性耳聋患者四个耳聋基因突变谱的筛查[J].中华检验医学杂志，2010，11：1083-1087.

Study on common gene mutation of the deaf population in Dalian

MOU Shu-yu1， LIU Lin1， CUI Ling1，ZHAO Li-yang1， BAI Hua1， BIE Xu2， SUN Xiu-zhen2

(1.DepartmentofOtolaryngology,DalianFriendshipHospital,Dalian116001,China;2.DepartmentofOtolaryngology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

Objective To screen and analysis the most common pathologic genes which are carried and distributed in the deaf population in Dalian, to explore the characteristics and incidence rate of the deafness patients in Dalian.Methods 5266 deafness patients were detected with the gene chip, which is able to perform mutation detection of 9 hot-spot mutations in four most common pathologic genes,including GJB2(35delG，176del16，235delC and 299delAT), SLC26A4(2168A>G and IVS7-2A>G), mtDNA12SrRNA (1555A>G,1494C>T), GJB3538C>T simutaneously. The datas were analyzed by using SPSS19.0 software.Results Among the 5 246 deafness patients, 1 416 cases were found to carry the most common pathologic genes (26.89%, 1 416/5 266), GJB2 gene mutation carriers in 657 cases (12.48%, 657/5 266), SLC26A4 gene mutation carriers in 512 cases (9.72%, 512/5 266), mtDNA 12S rRNA carriers in 239 cases (4.54%, 239/5 266), GJB3 gene mutation carriers in 8 cases (0.15%, 10/5 266). Conclusion The gene chip can be efficiently and quickly used in large sample populations, especially for the large-scale s gene defect screening. The mutation rate is relatively low for the deaf population in Dalian.

deafness;genechip;screening;GJB2;SLC26A4;mtDNA12SrRNA;GJB3

论 著

10.11724/jdmu.2015.01.08

国家自然科学基金项目(11472074)； 大连市科技计划项目(2010)

牟书瑜(1957-)，女，内蒙古赤峰人，主任医师。E-mail：mushuyu@gmail.com

别 旭，副教授。E-mail：bx5581@sina.com

R764.21

A

1671-7295(2015)01-0034-03

牟书瑜，刘琳，崔玲，等. 大连地区耳聋人群常见聋病基因突变的研究[J].大连医科大学学报，2015,37(1)：34-36.

2014-12-19；

2015-01-19)