小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠各脑区p-p38蛋白及c-myc mRNA表达的影响

李 妍，侯金龙，牛栋梁， 姜 胜，时 静，范宏刚，王洪斌

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠各脑区p-p38蛋白及c-mycmRNA表达的影响

李 妍#，侯金龙#，牛栋梁， 姜 胜，时 静，范宏刚，王洪斌*

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

旨在研究小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区p-p38蛋白及c-mycmRNA表达的影响，探讨小型猪复合麻醉颉颃剂的催醒机制。将18只大鼠随机分为C组(对照组)、J组(麻醉颉颃剂组)。J组又分为2个亚组，即J1组(注射小型猪专用复合麻醉颉颃剂5 min)、J2 组(注射小型猪专用复合麻醉颉颃剂1 h)。各组大鼠到达相应的时间点后断头处死，分离大脑皮层、小脑、海马、脑干和丘脑，用Western blot的方法检测p-p38蛋白的表达量，实时荧光定量PCR方法检测c-myc基因mRNA的转录量。试验结果显示大鼠大脑皮层、丘脑和脑干的p-p38蛋白和c-mycmRNA的相对表达量显著升高，而小脑和海马的p-p38蛋白和c-mycmRNA的相对表达量显著降低。综合试验结果，小型猪复合麻醉颉颃剂能够影响p-p38蛋白和c-mycmRNA的表达，这可能是其产生催醒作用的机制之一。

小型猪专用复合麻醉颉颃剂；催醒机制；p-p38蛋白；c-mycmRNA

小型猪复合麻醉颉颃剂是针对小型猪复合麻醉剂(XFM)研制的特异性催醒剂。前期的试验结果表明该颉颃剂能够使XFM麻醉状态下的小型猪平稳苏醒，无复睡现象，且对机体生理机能影响小，安全性较高[1-3]。然而小型猪复合麻醉颉颃剂产生催醒作用的机制尚不明确。近年来研究发现麻醉剂(如异氟醚、七氟醚和异丙酚等)能够影响p38MAPK信号转导通路，由此推测p38MAPK信号转导通路可能与麻醉作用机制相关[4-8]。前期的研究表明XFM能够影响p38MAPK信号转导通路的下游效应物c-mycmRNA的转录[9]。麻醉与催醒是两个相对的药物作用过程，小型猪复合麻醉颉颃剂产生催醒作用的机制可能与p38MAPK信号转导通路有关。本试验主要研究小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区p-p38蛋白及c-mycmRNA转录的影响，探讨小型猪复合麻醉颉颃剂的催醒机制，为进一步深入研究p38MAPK信号转导通路参与催醒作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小型猪复合麻醉颉颃剂由东北农业大学外科教研室提供，Trizol试剂(北京全式金生物技术有限公司)，反转录试剂盒(东洋纺(上海)生物科技有限公司)，荧光定量PCR试剂(宝生物工程(大连)有限公司)，Mouse Anti-beta Actin Monoclonal Antibody (北京中杉金桥生物技术有限公司，货号TA-09)、p-p38(Tyr182)(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZS-101759)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Roche Light Cycler 2.0 荧光定量PCR仪，Sigma高速低温离心机，Gene Quant 1300紫外可见分光光度计，电泳仪，酶标仪。

1.2 动物分组及样品采集

将18只大鼠随机分为C组(对照组)、J组(颉颃剂组)。J组又分为2个亚组，即J1组(注射小型猪复合麻醉颉颃剂5 min)、J2 组(注射小型猪复合麻醉颉颃剂1 h)。每组6只。C组大鼠注射等量的生理盐水。各组大鼠到达相应的时间点后分别断头处死，取出全脑，迅速置于冰面上，分离大脑皮层、海马、丘脑、脑干和小脑等部位，置于DEPC处理过的冻存管中，液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1.3 试验方法

1.3.1 Western blot测定p-p38的含量 采用BCA法测定各脑区总蛋白浓度，吸取样品，使每孔加入样品量为25 μg，加入样品缓冲液补足至20 μL，置于EP管中，沸水煮5 min，置于-80 ℃环境中，备用。以兔抗大鼠p-p38为一抗(1∶400稀释)，辣根酶标记羊抗兔Ig为二抗(1∶3 000 稀释)，采用底物增强化学发光ECL法显色，用X光片压片或者凝胶成像系统曝光。应用Gel-Pro analyzer 4软件进行光密度扫描定量，目的蛋白光密度值/内参光密度值，得到各组蛋白条带相对值进行比较。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测c-mycmRNA转录 采用Trizol法提取各脑区组织中总RNA，并用分光光度计测OD260 nm/OD280 nm的比值，通过琼脂糖凝胶电泳确定产物。根据反转录试剂盒说明书步骤，反转录总RNA得到第一链cDNA。根据GenBank中大鼠的β-actin(NM_031144.3)、c-myc(NM_012603.2)的基因序列，利用Primer 5.0进行引物设计，β-actin上下游引物分别为：5′-AGGGAAA-TCGTGCGTGACAT-3′，5′-CCTCGGGGCATCGGAA-3′，扩增片段为163 bp；c-myc上下游引物分别为：5′-CGACAGTCACGACGATGCC-3′，5′-CT-GCTGTTGCTGGTGATAGA -3′，扩增片段为125 bp；由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各脑区p-p38蛋白的含量

大鼠注射小型猪复合麻醉颉颃剂5min后，大脑皮层和脑干p-p38蛋白的表达量显著升高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，海马p-p38蛋白的表达量显著降低，与对照组相比差异显著(P<0.05)；大鼠注射小型猪复合麻醉颉颃剂1h后，大脑皮层p-p38蛋白的表达量恢复到正常水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05)，脑干p-p38蛋白的表达量显著升高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，小脑p-p38蛋白的表达量显著降低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，丘脑p-p38蛋白的表达量显著升高，与对照组相比差异显著(P<0.05)，海马p-p38蛋白的表达量恢复到正常水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结果如图1、表1所示。

图1 大鼠脑干β-actin和p-p38蛋白免疫印迹结果Fig.1 The β-actin and p-p38 protein expression of brainstem

组别Group大脑皮层Cerebralcortex小脑Cerebellum海马Hippocampus脑干Brainstem丘脑ThalamusC组 Cgroup0.31±0.030.34±0.040.13±0.031.54±0.081.41±0.08J1组 J1group0.53±0.11B0.25±0.030.06±0.02A2.49±0.04B1.52±0.06J2组 J2group0.35±0.030.18±0.06B0.16±0.033.58±0.31B1.54±0.03A

与对照组相比，A表示差异显著(P<0.05)，B表示差异极显著(P<0.01)。下表同

Compared with control group，A represented the difference is significant (P<0.05),B represented the difference is very significant (P<0.01).The same as follows

2.2 RNA纯度及完整性的鉴定结果

提取的总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳分离后，可见28S、18S及5S RNA条带较清晰，说明总RNA无明显降解，每个样品测OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0，说明RNA样品质量符合实时荧光定量PCR试验要求。

2.3 实时荧光定量PCR扩增结果

取Real Time PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，产物条带清晰，且实时荧光定量PCR产物无引物二聚体和杂带的出现，熔解曲线分析结果均为单峰，β-actinTm值为86.6 ℃，c-mycTm值为84.8 ℃，证明引物特异性良好，无非特异性扩增。倍比稀释的 cDNA 标准模板后得标准曲线，β-actin标准曲线的相关系数R2=0.998 1，扩增效率为1.016 3；c-myc标准曲线的相关系数R2=0.992 3，扩增效率为1.039。结果如图2所示。

2.4 中枢神经系统c-mycmRNA转录变化

大鼠注射小型猪复合麻醉颉颃剂5 min(J1组)，大脑皮层c-mycmRNA的转录量显著升高，与对照组相比差异显著(P<0.05)；小脑c-mycmRNA的转录量显著降低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)；海马c-mycmRNA的转录量显著降低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)；脑干和丘脑c-mycmRNA的转录量显著升高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。大鼠注射小型猪复合麻醉颉颃剂1 h后(J2组)，大脑皮层c-mycmRNA恢复正常水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05)；小脑c-mycmRNA的转录量1 h后(J2组)有所回升，但与对照组相比，差异显著(P<0.05)；海马c-mycmRNA的转录量1 h后(J2组)有所升高，但未升高到正常水平，与对照组相比差异显著(P<0.05)；脑干和丘脑c-mycmRNA的表达量1 h后(J2组)有所下降，但未下降到正常水平，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。(表2)

3 讨 论

p38蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成员，可被外界环境因素如化学物质、热/渗透性休克、紫外线、氧化失衡，或者某些生理性原因如促有丝分裂/促发育信号、神经递质、炎性因子等刺激物激活，继而介导凋亡等细胞反应[10]。p38MAPK主要在MKK的作用下成为有活性的磷酸化p38[11-12]，然后进一步将信号向下游传递。c-myc为p38下游信号分子之一[13]，是调控细胞增殖的重要基因，与细胞的生长、分化有关，对凋亡也起重要作用[14]。

M.DL2000 DNA 相对分子质量标准；1.β-actin PCR产物凝胶电泳结果；2.c-myc PCR产物凝胶电泳结果M.DL2000 DNA marker；1.PCR product of β-actin；2.PCR product of c-myc图2 β-actin、c-myc PCR产物电泳结果及扩增曲线Fig 2 The product of β-actin，c-myc PCR and the amplification curve

组别Group大脑皮层Cerebralcortex小脑Cerebellum海马Hippocampus脑干Brainstem丘脑ThalamusC组 Cgroup2.88±0.091.51±0.051.02±0.101.23±0.031.75±0.05J1组 J1group3.13±0.12A1.15±0.06B0.73±0.11B3.79±0.11B2.67±0.08BJ2组 J2group2.76±0.081.40±0.06A0.94±0.07A3.19±0.17B2.45±0.06B

近年来研究发现p38MAPK信号转导通路在神经系统中发挥重要的作用，尤其是在学习记忆过程中。手术、麻醉等因素能够引起术后认知功能障碍(POCD)，研究报道p38MAPK通路可被应激刺激、炎性因子等激活，全身麻醉药(异氟烷等)诱导炎症因子的表达，并通过炎症因子进一步激活p38MAPK通路，从而诱发新生大鼠的学习与记忆功能损害[4]。全身麻醉药与p38MAPK信号通路密切相关，研究发现吸入麻醉剂——异氟醚、七氟醚能够影响大鼠中枢神经系统中p38的表达[5-6]；此外也有静脉麻醉剂(异丙酚)对大鼠脑星形胶质细胞中p38表达的影响[7-8]的报道。综上，可以看出p38MAPK信号转导通路与麻醉机制存在一定的联系。

通过预试验，大鼠在注射XFM翻正反射消失后，注射小型猪复合麻醉颉颃剂，大鼠翻正反射恢复的时间大约为5.2 min，说明小型猪复合麻醉颉颃剂在这个时间范围内发挥了催醒作用，因此设定了5 min为颉颃剂组的一个采样时间点，为了观察小型猪复合麻醉颉颃剂的催醒之后的作用，设定了1 h为颉颃剂组的另一个采样时间点。

在本试验中，大鼠根据不同组别进行处理后，分别注射小型猪专用复合麻醉颉颃剂在不同的时间点采取大脑皮层、小脑、海马、脑干和丘脑，应用Western blot方法检测p-p38蛋白的相对表达量，试验结果显示大脑皮层、丘脑和脑干的p-p38蛋白的相对表达量显著升高，而小脑和海马的p-p38蛋白的相对表达量显著降低；结果提示小型猪复合麻醉颉颃剂对大脑皮层、丘脑和脑干的p-p38蛋白的相对表达量有促进作用，对小脑和海马的p-p38蛋白的相对表达量有抑制作用。综合以上分析可知小型猪复合麻醉颉颃剂影响脑内p-p38蛋白的表达。有研究表明，静脉麻醉剂异丙酚能够降低氨处理大鼠脑皮质星形胶质细胞磷酸化p38蛋白的含量，抑制p38MAPK信号通路的激活[7]，这与本试验中大脑皮层p-p38蛋白的含量升高结果相反。吸入麻醉剂异氟醚能够提高海马脑区p38蛋白的含量激活p38MAPK信号通路，从而诱发大鼠认知功能障碍[6]，这与本试验中海马脑区p-p38蛋白的含量降低结果相反。实时荧光定量PCR结果显示大脑皮层、丘脑和脑干的c-mycmRNA的相对转录量显著升高，而小脑和海马的c-mycmRNA的相对转录量显著降低。提示小型猪专用复合麻醉颉颃剂对大脑皮层、丘脑和脑干的c-mycmRNA的相对转录量有促进作用，对小脑和海马的c-mycmRNA的相对转录量有抑制作用。大鼠各脑区c-mycmRNA的变化趋势与p-p38蛋白的变化趋势基本一致。以往研究表明，p38MARK可以通过增强c-myc转录引起细胞凋亡[13-14]。本试验结果显示小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠海马和小脑区p-p38蛋白表达和c-mycmRNA转录均有抑制作用，所以推测小型猪复合麻醉颉颃剂可能通过降低大鼠海马和小脑区p-p38蛋白表达和c-mycmRNA转录从而降低对中枢神经的抑制作用，达到催醒效果。这可能是小型猪复合麻醉颉颃剂产生催醒作用的机制之一。

4 结 论

小型猪复合麻醉颉颃剂能够降低大鼠海马和小脑区p-p38蛋白表达和c-mycmRNA转录，这可能是小型猪复合麻醉颉颃剂催醒XFM麻醉的重要机制之一。

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(编辑 白永平)

Effect of the Antagonist for the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs on p-p38 Protein andc-mycGene in Brain Regions of Rats

LI Yan#，HOU Jin-long#，NIU Dong-liang，JIANG Sheng， SHI Jing，FAN Hong-gang，WANG Hong-bin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In order to investigate the effects of antagonist for the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs (XFM) on p-p38 protein andc-mycgene in different encephalic region of rats，and discuss the mechanism of XFM antagonist.Eighteen Wistar rats were divided randomly into C (Control group) and J (Antagonist group) group.J group consisted of two subgroups，J1(5 min after rats received the XFM antagonist intraperitoneally) and J2 (1 h after rats received the XFM antagonist intraperitoneally).The brain tissues were collected at each time point.The expression of p-p38 in different brains regions were detected by Western blot.The transcription ofc-mycmRNA in different brains regions were detected by real time PCR.The results showed that the expression of p-p38 andc-mycmRNA in cerebral cortex，thalamus and brain stem increased significantly；the expression of p-p38 andc-mycmRNA in cerebellum and hippocampus decreased significantly.These results indicated that p-p38 protein andc-mycgene were affected by the XFM antagonist，this may be one of the antagonism mechanisms.

antagonist for XFM；antagonism mechanism；p-p38 protein；c-mycmRNA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.020

2014-04-10

国家自然科学基金项目(31272617；31001092)

李 妍(1988-)，女，河南安阳人，硕士，主要从事麻醉与镇痛研究，E-mail：liyan8835@yeah.net；侯金龙(1986-)，男，助理实验师，主要从事动物麻醉研究，E-mail：2680310282@qq.com。二人对本文同等贡献，共为第一作者

*通信作者：王洪斌，教授，博士生导师，E-mail：neau1940@yahoo.com.cn

S859.791

A

0366-6964(2015)02-0317-06