慢性乙型肝炎患者治疗前后乙型肝炎病毒YMDD突变情况分析

彭 瑛，邓正华，温先勇

（泸州医学院附属医院检验科，四川泸州646000）

慢性乙型肝炎患者治疗前后乙型肝炎病毒YMDD突变情况分析

彭 瑛，邓正华，温先勇

（泸州医学院附属医院检验科，四川泸州646000）

目的采用Taqman荧光探针技术对慢性乙型肝炎（乙肝）患者血清中乙肝病毒P基因区550位点的突变情况进行检测，对该院慢性乙肝患者乙肝病毒YMDD突变情况进行调查，为指导临床使用拉米夫定对乙肝患者进行治疗提供重要的参考依据。方法2013年2～12月选取HBVDNA定量在2.00E+03 IU以上的慢性乙肝患者186例，其中90例未经过治疗（未治疗组），96例使用拉米夫定治疗1年以上（治疗组）。其血清采用聚合酶链式反应结合Taqman荧光探针技术，分C、I、V三组，分别对总HBVDNA（包括野生型和突变型DNA），YIDD突变DNA，YVDD突变DNA进行检测。结果186例慢性乙肝患者中发生P基因区变异者共87例，其中治疗组患者发生YIDD变异9例（9.4%），发生YVDD变异36例（37.5%），YIDD和YVDD同时变异6例（6.2%）；未治疗组患者发生YIDD变异6例（6.7%），发生YVDD变异24例（26.7%），YIDD和YVDD同时变异6例（6.7%）。两组患者YIDD变异、YVDD变异及YIDD和YVDD同时变异发生情况比较，差异均无统计学意义（χ2=0.011、0.156、0.206，P＞0.05）。结论经过拉米夫定治疗的患者乙肝病毒P基因区发生变异的频率高，但未经治疗的慢性乙肝患者体内的乙肝病毒也可自然发生P基因区的变异，故在治疗前及治疗中进行耐药基因的检测对指导临床治疗用药具有重要意义。

肝炎，乙型，慢性； 肝炎病毒，乙型； 拉米夫定； DNA，病毒

拉米夫定是核苷类抗病毒药物，已广泛应用于慢性乙型肝炎患者的抗病毒治疗，它与乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶结合后，竞争性抑制多聚酶活性，使HBVDNA链的合成终止，从而有效地抑制HBV DNA的复制[1]。但是长期服用拉米夫定的患者会引起病毒变异而产生耐药性。经研究发现，变异主要发生在HBV DNA多聚酶酪氨酸（Y）、甲硫氨酸（M）、天门冬氨酸（D）、天门冬氨酸（D），即YMDD基序区，即由异亮氨酸（I）取代甲硫氨酸（M）和由缬氨酸（V）取代甲硫氨酸（M）产生YIDD和

YVDD变异[2]。本研究采用聚合酶链反应（PCR）荧光法定性检测乙型肝炎患者血清中与拉米夫定耐药有关的HBV DNA多聚酶基因YMDD突变（YMDD变异为YIDD或YVDD，即550ATG变异为GTG及550ATG变异为ATT），对本院慢性乙型肝炎患者HBV DNA多聚酶YMDD突变情况进行分析，为临床用药提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 本研究186例患者均为2013年2～12月在本院临床治疗的慢性乙型肝炎患者，其中男116例，女70例，年龄19～76岁，实时荧光PCR定量检测HBV DNA结果都在2.00 E+03 IU以上。接受拉米夫定治疗1年以上者96例（治疗组），未接受治疗者90例（未治疗组）。对乙型肝炎的诊断均符合2000年中华传染病与寄生虫病分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案的诊断标准。

1.1.2 仪器与试剂 美国应用生物技术公司生产的ABI7500 fastRT荧光定量PCR仪；上海生物科技有限公司乙型肝炎病毒YMDD基因突变试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 样本采集用生化促凝真空管取患者静脉血5mL，3 000 r/min离心10min，取血清200μL，-20℃冻存待用。

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 样本的处理 严格按照说明说在生物安全柜中操作。

1.2.2.2 PCR扩增 分3管进行平行检测，其中C检测管检测样本中的总HBVDNA，包括野生型和突变型DNA，I检测管检测YIDD突变DNA，V检测管检测YVDD突变DNA，并使用dUTP和UNG酶防止扩增产物的污染。将25μL反应体系置于ABI7500荧光PCR扩增仪上。PCR扩增条件：50℃2min，94℃保温5min，再按94℃20 s、53℃30 s循环40次，53℃30 s处收集荧光。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或百分比表示，采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

186例慢性乙型肝炎患者中发生P基因区变异者共有87例，其中治疗组发生YIDD变异9例，发生YVDD变异36例，YIDD和YVDD同时变异6例；未治疗组发生YIDD变异6例，发生YVDD变异24例，YIDD和YVDD同时变异6例。两组患者YIDD变异、YVDD变异及YIDD和YVDD同时变异发生情况比较，差异均无统计学意义（χ2=0.011、0.156、0.206，P＞0.05），见表1。

表1 两组患者发生P基因区变异情况比较[n（%）]

3 讨 论

乙型肝炎是由HBV引起的一种全球肆虐的疾病，我国是世界上HBV感染最严重的国家，严重威胁着人类的健康。拉米夫定是具有强大抑制病毒复制作用的新一代核苷类药物，该药是RNA逆转录酶的有效抑制剂，通过抑制HBV DNA聚合酶而减少复制中间体，阻断cccDNA的合成，使HBV感染不能持续[3]。其作用：（1）降低HBV DNA的浓度；（2）改善肝脏组织的病变；（3）可能阻断肝纤维化的进程，终止肝硬化的发展；（4）不受人种、病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响；（5）可口服，不良反应小[4]。除 HBV感染者YMDD存在自然变异外，长期服用拉米夫定会出现HBV基因变异而产生耐药。目前比较明确与耐药相关的主要是HBV DNA多聚酶活性YMDD基因序列的变异，即HBV中蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）取代，形成YVDD（即第550位核苷酸甲硫氨酸被异亮氨酸取代）YIDD变异（即第550位核苷酸甲硫氨酸被缬氨酸取代）。该部位正是拉米夫定干扰HBV复制的结合点，该区的基因突变导致相应氨基酸发生改变，空间构象随之改变，拉米夫定无法与之结合，丧失了抗病毒活性。

随着HBV治疗药物拉米夫定的广泛使用，HBV耐药现象的出现已成为临床应用的一个棘手问题，盲目用药只会导致耐药情况加重，有效测定HBV耐药相关DNA突变成为指导HBV临床用药，提高治疗效率，降低费用的重要手段，于是耐药基因检测方法的研究成为热点。有研究证实，实时荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异，无须使用外在定量标准，提高了检测效率，降低了检测成本，具有快速、灵敏、准确、经济实用等优点，适合临床实验室开展拉米夫定耐药性突变的监测[5]。

本实验采用PCR Taqman荧光定量PCR技术，分C、I、V三组，分别对总HBV DNA（包括野生型和突变型DNA），YIDD突变DNA，YVDD突变DNA进行检测。通过研究结果可以看出186例慢性乙型肝炎患者中发生P基因区变异者共有87例，占46.8%。其中经拉米夫定治疗的患者发生YIDD变异者9例，占9.4%，发生YVDD变异者36例，占37.5%，YIDD和YVDD同时变异者6例，占6.2%；未治疗患者发生YIDD单一变异者6例，占6.7%，发生YVDD变异者24例，占26.7%，YIDD和YVDD同时变异者6例，占6.7%。可见经拉米夫定治疗后发生变异的频率更高，其中以YVDD变异最多，其次为YIDD变异及YIDD+YVDD变异，与普冬等[6]报道相近。未经治疗的慢性乙型肝炎患者体内的HBV也可自然发生P基因区的变异，与相关报道相符[7-10]。两组患者YIDD变异、YVDD变异及YIDD和YVDD同时变异发生情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

综上所述，YMDD变异株的发生会影响拉米夫定的抗病毒效果，因此在治疗过程中进行YMDD变异的检测是非常必要的。必须指出的是，由于存在YMDD自然突变，所以对进行抗病毒治疗前的患者，也应检测有无YMDD变异，以便指导临床医生科学合理地制订抗病毒治疗方案，从而达到更好的疗效。

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Analysisof HBV YMDDmutations in patientsw ith chronic hepatitis B before and after lam ivudine therapy

Peng Ying，Deng Zhenghua，Wen Xianyong
（Departmentof Laboratory Medicine，the Affiliated Hospitalof LuZhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveA totalof550 locusmutationsofhepatitis B virus in the Pgene regionwas detected by Taqman fluorescentprobe among the patients′serum with chronic hepatitis B.A survey on patientswith hepatitis B virus YMDDmutations in this hospitalwere conducted to guide the clinical use of lamivudine and provide an provide an important reference in clinic.MethodsItwas collected 186 chronic HBV patients from February to December of2013，whose HBV DNA quantification was more than 2.00E+03 IU，inwhich，90 patientswere deemed as the non-treatmentgroup and 96 as the treatmentgroup with lamivudine for over 1 year.These patients′serum was detected by polymerase chain reaction combined with Taqman fluorescent probe and divided into group C，Iand V，and detecting their total HBV DNA（thewild-type andmutantDNA），YIDDmutantDNA and YVDDmutantDNA respectively.ResultsTherewere 87 caseswith Pgene variation among the 186 patientswith chronic HBV，in which，9 cases in the treatmentgroup had YIDD variation，accounting for9.4%，36 cases occurred YVDD variation，accounting for 37.5%，6 with YIDD and YVDD variation，accounting for 6.2%；6 cases in the non-treatment group had YIDD variation，accounting for 6.7%，24 cases occurred YVDD variation，accounting for 26.7%，6 with YIDD and YVDD variation，accounting for 6.7%.The variations of YIDD，YVDD and YIDD&YVDD were compared simultaneously.The differencewas statistically significant（χ2=0.011，0.156，0.206，P＞0.05）.ConclusionThe patients treated by lamivudinewere ofhigh occurrence ofmutations in hepatitis B virus Pgene region.The chronic hepatitis B patientswithout the treatmentoccurred naturally variation of hepatitis B virusPgene region.Therefore，detecting drug-resistantgene before orduring the treatment is important in guiding clinical therapy.

Hepatitis B，chronic； HepatitisB virus； Lamivudine； DNA，viral

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.012

：A

：1009-5519（2015）07-0991-02

2014-11-15）

彭瑛（1977-），女，四川泸州人，硕士研究生，主管技师，主要从事临床检验工作；E-mail：850771970@qq.com。