黄芪对脓毒症大鼠辅助性T细胞功能的影响及意义

涂丹娜，周小勤，舒俊华

（湖北省妇幼保健院儿内科，武汉430070）

黄芪对脓毒症大鼠辅助性T细胞功能的影响及意义

涂丹娜，周小勤，舒俊华

（湖北省妇幼保健院儿内科，武汉430070）

目的探讨黄芪对脓毒症大鼠模型外周血单核细胞（PBMC）及支气管肺泡灌洗液（BALF）中Th1/Th2失衡的影响及意义。方法60只清洁级SD大鼠随机分为对照组[C组，早期对照组（EC组）和晚期对照组（LC）]、脓毒症组[S组，早期脓毒症组（ES）和晚期脓毒症组（LS）]及脓毒血症黄芪干预组[H组，早期干预组（EH）和晚期干预组（LH）]，每组10只。采用酶联免疫吸附试验检测各组大鼠PBMC及BALF中的干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）表达水平，并计算IFN-γ/IL-4的比值。结果S组大鼠PBMC和BALF中的IFN-γ表达均较C组和H组显著下降，且在PBMC中这种下降趋势呈时间依赖性，而IL-4表达水平显著上升，IFN-γ/IL-4表达随着时间延续进行性下调，差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）。结论辅助性T细胞功能失衡参与了脓毒症的进展，黄芪可抑制脓毒症大鼠中的炎性反应，改善其免疫失衡。

脓毒症； 黄芪； T淋巴细胞； 干扰素-γ； 白细胞介素4

儿童脓毒症/严重脓毒症是儿科重症监护病房中一种常见且病死率较高的疾病[1]。多器官功能衰竭是导致患儿死亡的主要原因，其中尤以呼吸系统功能障碍为常见[2]。大量研究表明，在脓毒症的发病过程中，机体并不是处于稳定的炎症激活状态，同时还伴免疫抑制，这可能是导致临床抗炎治疗失败的原因之一[3]。黄芪是我国传统的“扶正固本，补中益气”的药物，其作用与免疫调节息息相关。本研究采用黄芪注射液对脓毒症大鼠模型进行干预，并检测其外周血单核细胞（PBMC）及支气管肺泡灌洗液（BALF）中辅助性T淋巴细胞（Th）功能，探讨黄芪对脓毒症大鼠Th1/Th2失衡的影响及意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 清洁级SD雄性大鼠60只（武汉大学实验动物中心提供），体质量（250±30）g。大鼠染色编号，随机分成三组，每组20只，每组根据术后留取样本的时间又分为早期组（术后8~10 h）和晚期组（术后16~18 h）。C组（对照组）分为早期对照组（EC，n=10）和晚期对照组（LC，n=10）；S组（脓毒血症组）分为早期脓毒血症组（ES，n=10）和晚期脓毒血症组（LS，n=10）；H组（脓毒血症黄芪干预组）分为早期干预组（EH，n=10）和晚期干预组（LH，n=10）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型复制及给药方法 实验动物进行试验性饲养1周后，H组采用黄芪注射液按5mL/kg腹腔注射3周，每天1次，黄芪注射液购自正大青春宝药业有限公司（20 g/10mL，批号：1306131），其余两组采用等量生理盐水腹腔注射3周，每天1次。各组大鼠术前禁食过夜，自由饮水。动物经3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，行盲肠中远端1/3结扎术，并在盲肠末端用18号针头穿孔，保留近端盲肠血供，逐层缝合腹壁切口，C组除不结扎盲肠和穿孔外，其余操作与其他实验组一致。分别于术后即刻及术后7 h于大鼠背部皮下注射生理盐水（4 mL/100g）以防脱水。

1.2.2 标本收集 实验结束时每只大鼠采血2mL，肝素钠抗凝。大鼠左肺留取肺组织，右肺经气管切口使用生理盐水进行灌洗，每次5mL，共3次，回收率80%以上。BALF经2 000 r/min离心15min，取上清液于离心管-70℃保存用以测定干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）的浓度。

1.2.3 细胞培养 淋巴细胞分离液分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为1.5×106mL-1，加入植物血凝素（PHA）100mg/L，37℃、5%CO2培养箱培养48h后，收集上清液储存于-20℃用于细胞因子检测。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）细胞因子检测 采用ELISA方法，所用操作步骤均按照说明书进行。IFN-γ和IL-4检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，IFN-γ最低检测值15.625 pg/mL，IL-4最低检测值8 pg/mL。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组PBMC培养上清液中IFN-γ及IL-4浓度比较 与C组比较，S组和H组大鼠的PBMC中IFN-γ表达水平均明显下降，H组大鼠IFN-γ表达水平较S组有明显提升，差异均有统计学意义（P＜0.01）；且LS及LH组分别较ES及EH组下降更显著，差异均有统计学意义 （P＜0.01）；S组和H组的IL-4水平表达较C组明显升高，而LH组的升高幅度较LS组低，差异均有统计学意义（P＜0.05），ES组和EH组的IL-4表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。IFN-γ/IL-4比值S组和H组均明显低于C组，而H组IFN-γ/IL-4比值较S组呈明显上升趋势，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 各组PBMC培养上清液中IFN-γ及IL-4浓度比较（±s）

表1 各组PBMC培养上清液中IFN-γ及IL-4浓度比较（±s）

注：与C组同期比较，aP＜0.01；与S组同期比较，bP＜0.01，cP＜0.05。

组别EC组LC组ES组LS组EH组LH组n IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4 10 10 10 10 10 10 117.93±14.67 115.52±11.53 66.78±9.43a52.52±9.34a89.73±11.77ab73.80±12.44ab28.10±5.48 29.28±3.50 37.91±4.89a41.51±5.65a34.97±5.84a35.31±4.60ac4.24±0.71 3.96±0.64 1.77±0.42a1.26±0.39a2.58±0.63ab2.08±0.53ab

2.2 各组BALF中IFN-γ及IL-4浓度比较 S组和H组BALF中IFN-γ表达水平较C组均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01或0.05）；H组的IFN-γ表达水平较S组有所提升，且LH较EH组下降更为显著，差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）；而ES组与LS组IFN-γ表达水平比较，差异无明显统计学差异（P＞0.05）。与C组比较，IL-4的表达在S组和H组的BALF中明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），但两组差异无统计学意义（P＞0.05）。S组和H组中IFN-γ/IL-4的比值均明显低于C组，而H组中IFN-γ/IL-4的比值与S组比较，呈明显上升趋势，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 各组BALF中IFN-γ及IL-4浓度比较（±s）

表2 各组BALF中IFN-γ及IL-4浓度比较（±s）

注：与C组同期比较，aP＜0.05；与S组同期比较，bP＜0.05；与EH组比较，cP＜0.05。

组别EC组LC组ES组LS组EH组LH组n IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4 3.84±0.73 3.75±0.77 1.38±0.35a1.14±0.21a2.12±0.47ab1.78±0.56ab10 10 10 10 10 10 84.33±9.87 83.59±11.77 50.51±7.79a44.75±9.48a71.96±13.18ab60.83±8.64abc21.99±2.79 22.39±3.17 36.68±5.88a39.08±6.23a33.87±5.43a34.37±6.45a

3 讨 论

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征。尤其对于儿童，由于其各系统器官生理功能不健全、免疫功能低下等特点，脓毒症的发病率及死亡率一直居高不下[4]。有研究表明，脓毒症是炎性反应、微循环障碍、凝血功能障碍、免疫抑制和神经-内分泌-免疫网络之间复杂作用的结果[5]。随着研究的深入，人们逐渐认识到“过度炎性反应”及“过度免疫抑制”在脓毒症的发生发展中起着重要作用。在脓毒症的发病过程中，机体并不是处于稳定的炎症激活状态，其病理生理状态可随时间而发生变化，呈现一种序贯反应。最新研究证明，免疫抑制甚至在脓毒症感染损伤初期即开始存在[6]，机体处于一种复杂的免疫紊乱和失衡状态。因此，免疫治疗的重点在于重建脓毒症患者的免疫平衡稳态[7]。Th在这一过程中执行着重要功能，它是机体重要的免疫调节细胞。现代免疫学认为，活化的Th按其功能和分泌细胞因子的不同至少可以分为2群：Th1细胞可以分泌IFN-γ而不分泌IL-4，主要介导细胞免疫应答；Th2细胞可以分泌IL-4而不分泌IFN-γ，主要介导体液免疫应答，通常以这2种细胞因子作为鉴别Th1和Th2的标志。本研究发现，脓毒症大鼠外周血单个核细胞的培养上清液中，IFN-γ的表达水平显著下降，而IL-4表达水平明显上升，表明Th2功能亢进，并且随着时间的延续，IFN-γ表达水平持续下降，而IFN-γ/IL-4的比值亦呈下降趋势，Th1向Th2发生进行性偏移。

前期的临床观察研究发现，下呼吸道感染是脓毒症感染的主要途径，而多器官功能衰竭是导致儿童脓毒症死亡的主要原因，其中尤以呼吸系统功能障最为常见[2]。BALF直接来源于下呼吸道，更能直观地反映病灶局部的生理及病理生理改变情况。有研究表明，重症支原体肺炎患儿BALF中存在Th1/Th2失衡，以Th2反应占优势[8]。本研究结果显示，在脓毒症大鼠模型的肺组织中有大量的单核细胞和淋巴细胞浸润，在脓毒症大鼠的BALF中，IFN-γ和IL-4的表达水平呈与PBMC培养上清液中相同趋势，Th2细胞功能随着时间的进展呈进行性亢进状态，脓毒症大鼠机体出现严重的免疫失衡。

黄芪是我国的传统中药，其味甘，性微温，具有益气固表、托毒排脓、利尿和敛创生肌等功效[9]。近年来研究发现，黄芪中含有黄芪多糖、皂苷类、黄酮类、氨基酸等多种化学成分，其药理作用广泛。黄芪可作用于机体免疫系统的各个环节，对细胞免疫、体液免疫及固有免疫均具有调节作用。它可作用于多种免疫活性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生成；能削弱或消除抑制性淋巴细胞（Ts）的活性；改善单核巨噬细胞的功能，增强巨噬细胞的吞噬作用，提高自然杀伤（NK）细胞的活性[10]。有文献报道，在脓毒症成年患者中，黄芪注射液能促进其总淋巴细胞、CD4、CD4/CD8水平的上调[11]。本研究结果显示，在脓毒症大鼠模型 PBMC及BALF中，黄芪可明显上调其IFN-γ的表达水平；对晚期脓毒症大鼠PBMC培养上清液中的IL-4的表达亦有抑制作用，但对BALF及早期脓毒症大鼠外周血中IL-4的表达水平没有明显影响，这可能与感染损伤及黄芪干预时间的长短有关。但是就Th1/Th2比值而言，无论是脓毒症大鼠模型感染的早期组还是晚期组，黄芪均能明显促进其Th2向Th1漂移，从而改善脓毒症大鼠机体的免疫失衡状态。

本研究尚存在一些不足之处，针对黄芪干预的时程及不同浓度黄芪干预后对脓毒症大鼠的Th功能的影响尚需予以证实。进一步的研究将对上述不足之处予以完善，并致力于通过对Th亚群功能的干预来延缓脓毒症的进程。

[1]刘春峰，张冰轮.儿童急救医学研究进展[J].中国实用儿科杂志，2013，28（5）：352-356.

[2]周小勤，涂丹娜，夏治.儿童脓毒症患病现状调查及死亡危险因素分析[J].实用医学杂志，2013，29（4）：606-608.

[3]杨虎，李运壁.儿童脓毒症发病机制及诊治进展[J].国际儿科学杂志，2014，41（2）：138-141.

[4]Cornell TT，Wynn J，Shanley TP，etal.Mechanismsand regulation of the gene-expression response to sepsis[J].Pediatrics，2010，125（6）：1248-1258.

[5]付圆.脓毒症发病机制的研究进展[J].中国现代医生，2014，52（11）：155-157.

[6]Giamarellos-BourboulisEJ，Tsaganos T，SpyridakiE，etal.Ear1y changes of CD4-positive lymphocytes and NK cells in patients with severe gram negativesepsis[J].CriticalCare，2006，10（6）：R166.

[7]杨荣利，刘大为.严重感染的免疫紊乱和免疫治疗进展[J].中国实用内科杂志，2007，27（14）：1139-1141.

[8]康妍萌，丁明杰，韩玉玲，等.重症肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液中Th1/Th2细胞免疫应答状况的研究[J].中国当代儿科杂志，2011，13（3）：188-190.

[9]左军，张文钊，胡晓阳，等.黄芪现代药理及临床研究进展[J].中医药信息，2014，31（1）：111-112.

[10]陈国辉，黄文凤.黄芪的化学成分及药理作用研究进展[J].中国新药杂志，2008，17（17）：1482-1485.

[11]陈扬波，张庚，胡马洪，等.黄芪注射液对脓毒症患者免疫功能的影响[J].中国中医急症，2008，17（12）：1699-1701.

Effectand significance of astragalusmembranaceus to helper T cells function of septic rats

Tu Danna，Zhou Xiaoqin，Shu Junhua
（Departmentof InternalPediatrics，HubeiProvincialMaternaland Children Health Care Hospital，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo approach the effectand significance ofastragalusmembranaceus to imbalance of Th1/Th2 in the peripheralbloodmononuclear cell（PBMC）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）ofseptic rats.MethodsA totalof clean 60 SD ratswere randomly divided into the controlgroup[group C including group EC and group LC]，the sepsisgroup[group S including group ESand group LS]and astragalusmembranaceus intervening group[group H including group EH and group LH]，10 of each group.It adopted enzyme-linked immunosorbent assay to detect the expression level of IFN-γand IL-4 in PBMC and BALF in the ratsofeach group and calculate the ratio of IFN-γ/IL-4.ResultsCompared to the group Cand group H，the expression levelof IFN-γin the PBMC and BALFofgroup Swere significantly decreased.The downtrend in the PBMC showed time dependencewhile the IL-4 expression levelwere improved obviously.With the time prolonging，the expression of IFN-γ/IL-4 in the PBMCand BALFof septic ratswas dropped progressively.The difference had statistical significance（P＜0.01 or 0.05）.ConclusionThe imbalance of helper T cells function participates to the development of sepsis.Astragalusmembranaceusmay inhibit the inflammatory responseofastragalusmembranaceus to improve their immunologic imbalance.

Sepsis； Radix Astragali； T-lymphocytes； Interferon-gamma； Interleukin-4

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.003

：A

：1009-5519（2015）07-0964-03

2014-12-26）

涂丹娜（1979-），女，湖北武汉人，博士研究生，主治医师，主要从事儿童感染与免疫方面的研究；E-mail：tdn_tutu@163.com。

周小勤（E-mail：62724838@163.com）。