高效液相色谱法测定牡蛎大豆肽肉碱口服液中维生素B6含量的不确定度评定

庞学斌，张 伟，邱颖姮，邬晓鸥

（深圳药品质量标准研究重点实验室/深圳市药品检验所，广东518057）

高效液相色谱法测定牡蛎大豆肽肉碱口服液中维生素B6含量的不确定度评定

庞学斌，张 伟，邱颖姮，邬晓鸥

（深圳药品质量标准研究重点实验室/深圳市药品检验所，广东518057）

目的评定高效液相色谱法（HPLC法）测定牡蛎大豆肽肉碱口服液中维生素B6含量的不确定度。方法采用HPLC法测定试样中维生素B6的含量，根据建测量模型，确定影响不确定度的分量，并加以评定量化，得出合成不确定度和扩展不确定度。结果试样中维生素B6含量测得值为0.498mg/100mL，其中B6含量的相对不确定度为0.024 9，标准不确定度为0.012 4mg/100mL，扩展不确定度为0.024 8mg/100mL（k=2）。结论建立的计算方法实用、可靠，可以用于HPLC法测定牡蛎大豆肽肉碱口服液中维生素B6含量的不确定度评定，经评定发现，高效液相色谱仪定量重复性对不确定度的影响最大。

色谱法，高压液相； 维生素B6； 牡蛎； 数学计算

随着测量技术的不断发展，描述测量准确程度的方法也不断发展，过去习惯用误差、准确度等概念来描述，从1995年开始，国际上正式使用不确定度来表达测量结果的分散程度[1-3]。测量结果通常表示为单个测得的量值和一个测量不确定度[4]。维生素B6是海王金樽牌牡蛎大豆肽肉碱口服液中的功效成分之一，能显著降低H型高血压患者的血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平[5]。目前对其用高效液相色谱法（HPLC法）进行含量测定的不确定度评定研究鲜有报道[6-7]。本研究依据相关资料与文献[8-10]，采用HPLC法对试样中维生素B6的含量进行测定，并评估影响不确定度的因素及其各个不确定度分量对测定结果的影响大小，建立适用于HPLC法测定该样品中维生素B6含量的不确定度评定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 XS105DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，d＝0.01mg）；Alliance e2695-2998高效液相色谱仪（美国Waters，配有2998DAD检测器）；容量瓶及移液管均为A级。

1.1.2 试剂 维生素B6对照品（SUPELCO，含量为99.9%，相对标准差：±0.5%）；乙腈（默克，色谱纯）；其余试剂如无特殊说明均为分析纯。

1.1.3 样品 海王金樽牌牡蛎大豆肽肉碱口服液（企业委托送检）。

1.2 方法

1.2.1 实验条件

1.2.1.1 实验室温度 （20±5）℃。

1.2.1.2 色谱条件 GL Sciences Inc.Inertsil ODS-3色谱柱（4.6mm×250.0mm，5.0μm）；流动相：1-庚烷磺酸钠溶液（1.22→850）；乙腈∶磷酸=850∶150∶1；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：280 nm。

1.2.2 测定方法 依据GB/T 5009.197-2003保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定方法，对试样中维生素B6的含量进行测定。

1.2.2.1 供试品溶液配制 将样品摇匀，经0.45μm滤膜过滤后待进样。

1.2.2.2 对照品溶液配制 精密称取维生素B6对照品（含量为99.9%）11.40mg，置于10mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，即得浓度为1.139mg/mL对照品储备溶液；量取1.00mL该储备溶液至200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得5.695μg/mL的对照品溶液。

1.2.2.3 测定 分别量取供试品溶液、对照品溶液各10μL注入HPLC仪，记录色谱图和峰面积。

1.2.3 不确定度来源分析

1.2.3.1 测量模型 依据GB/T5009.197-2003保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定方法，根据本实验具体情况，试样经滤过后直接进样，测量模型为：

本研究考虑了测量重复性引入的不确定度（包括样品不均匀、容器及仪器和其他因素引入的不确定度统一计算），加入复现性修正量R，其值视为零，不确定度非零。加入后模型式（1）变为模型式（2）：

模型式（2）、（3）中：X为每100毫升试样中维生素B6的含量（mg）；R为重复测量修正量；AT为供试品溶液的峰面积；CR为对照品溶液的浓度，μg/mL；100为mg/mL转换为mg/100mL的系数；1 000为μg转换为mg的系数；AR为对照品溶液的峰面积；0.1为100除以1 000的得数。

因此，根据模型（3），共3个输入量：AT、CR与AR，并考虑重复性，用因果图分析不确定来源，见图1、2所示。

图1 考虑测量重复性后的含量不确定度来源因果图

图2 含量不确定度来源因果图

1.2.3.2 合成不确定度表达式 模型式（2）是线性模型，合成标准不确定度表达式为：

其中uc（X′）为考虑测量重复性后含量的合成标准不确定度；u2（X）为测得值的方差；u2（R）为重复测量值的方差。

由于测量模型式（3）属于各输入量相乘的函数关系，依据JJF 1059.1-2012，试样中维生素B6的含量相对标准不确定度为：

其中：urel（X）为试样中维生素B6含量的相对标准不确定度；u2rel（AT）为供试品溶液峰面积的相对不确定度；u2rel（CR）为对照品溶液浓度的相对不确定度；u2rel（AR）为对照品溶液峰面积的相对不确定度。

2 结 果

2.1 不确定度评定 根据模型式（5），试样中维生素B6含量的相对标准不确定度由AT、CR和AR3个分量引入，结果评定如下。

2.1.1 供试品峰面积的相对标准urel（AT） 供试品峰面积的不确定度主要由HPLC仪进样的重复性引起[10]，查询仪器检定证书，其定量重复性相对标准偏差为3.0%，按矩形分布计算，供试品峰面积的相对标准为：

2.1.2 对照品溶液浓度的相对标准不确定度urel（CR）对照品溶液浓度的不确定度主要由天平、维生素B6对照品纯度、10mL容量瓶、移液管、200mL容量瓶等5个分量引入，以下为经分别计算的各自相对标准不确定度。

2.1.2.1 天平引入的相对不确定度u1rel（CR） 使用天平称取维生素B6对照品引入的不确定度来源有：（1）天平最大允许误差引入的不确定度评定，根据天平计量证书，在10mg量程的最大允许误差为0.05mg，按正态分布计算，其标准不确定度为：0.05/3=0.016 67mg。（2）分辨力导致的不确定度评定，根据天平计量证书，其分辨力为0.01mg，按矩形分布计算，其标准不确定度为：0.01/=0.005 78mg。（3）天平重复性导致的不确定度评定，由于本次实验做了10次独立重复实验，由天平重复性导致的不确定度忽略，故不加入天平不确定度的合成。所以天平导致的合成相对标准不确定度为：

2.1.2.2 维生素B6对照品纯度引入的相对不确定度u2rel（CR） 本次购买的SUPELCO公司的维生素B6对照品，其标准物质证书中标示含量为99.9%，相对标准偏差为0.5%，按矩形分布，维生素B6对照品纯度引入的相对不确定度为u2rel（CR）=0.005/3=2.89×10-3。

2.1.2.3 对照品定容至10mL容量瓶引入的相对标准不确定度u3rel（CR） 对照品定容至10mL容量瓶，得到维生素B6对照品储备液，其不确定度主要由允差、温度和重复性3个分量引入。（1）容量瓶允差：本次实验使用的10mL容量瓶为A级，允差为±0.020mL[11]，按三角分布，取包含因子k=，则其相对标准不确定度为：0.020//10=8.16×10-4。（2）温度引入的不确定度：由于实验室温度与玻璃仪器校准时温度不同引起体积差异而引入的不确定度为B类不确定度。纯水的体积膨胀系数（2.1×10-4/℃）比玻璃的体积膨胀系数（2.5×10-5/℃）明显要大[11]，故忽略后者。实验室温度在（20±5）℃，按矩形分布，取包含因子k=，则其相对标准不确定度为：5× 2.1×10-4×10//10=6.06×10-4。（3）重复性引入的不确定度：同天平重复引入的不确定度原因，本次不计入容量瓶不确定度评定。

由上可得对照品定容至10mL容量瓶引入的相对标准不确定度为：

2.1.2.4 1 mL移液管引入的相对标准不确定度u4rel（CR） 用1mL移液管（A级）量取维生素B6对照品储备液1mL，其不确定度主要由移液管允差、温度和重复性3个分量引入。计算过程与10mL容量瓶类似。（1）移液管允差：1mL移液管（A级）允差为±0.007mL[6]，其相对标准不确定度为：0.007//1=2.86×10-3。（2）温度：相对标准不确定度为：5×2.1×10-4×1//1=6.06×10-4。（3）重复性：不计入。

由上可得1mL移液管引入的相对标准不确定度为：

2.1.2.5 200mL容量瓶引入的相对标准不确定度u5rel（CR） 对照品储备液稀释并定容至200mL容量瓶，其不确定度来源与10mL容量瓶相同，计算过程与10mL容量瓶类似。（1）容量瓶允差：200mL容量瓶（A级）允差±0.15mL[11]，其相对不确定度为0.15//200=3.06× 10-4。（2）温度：相对标准不确定度为 5×2.1×10-4×200//200=6.06×10-4。（3）重复性：不计入。

由上可得200mL容量瓶引入的相对标准不确定度为：

所以，对照品溶液浓度（CR）的相对方差为：

所以，对照品溶液浓度（CR）的相对不确定度urel（CR）为4.55×10-3。

2.1.3 对照品峰面积的相对标准不确定度urel（AR） 与样品峰面积的相对标准不确定度相同，对照品峰面积的相对标准不确定度为：

综上所述，合并X、AT与AR3个分量相对标准不确定，得到试样中维生素B6含量的相对不确定度：

2.2 合成标准不确定度

2.2.1 试样中维生素B6含量的标准不确定度 测得3次对照品溶液峰面积分别为91 351、94 319、94 966μv/s，平均值为 93 545μv/s；3次样品溶液峰面积分别为82 014、81 809、81 628，平均值为81 817μv/s；对照品溶液溶度CR为5.695μg/mL，根据模型式（3），计算得到试样中维生素 B6的含量为每 100毫升 0.498 mg。

所以，试样中维生素B6含量的标准不确定度u（X）=urel（X）×X=0.024 9×0.498=0.012 4mg/100mL。

2.2.2 重复测量性引入的不确定度 人工操作和仪器读数都会带来重复性问题。与每一次测量结果直接相关的重复测量过程包括天平称量、容量瓶定容、移液管移液。为避免重复引入和计算方便，将天平称量操作的重复性、定容体积重复性、移液体积重复性这几项重复性分量合并为总测量过程的一个分量，由测量结果的重复性表示。

抽取同一批样品10份，按照同样测量程序进行平行测量，测量结果列于表1。

由贝塞尔公式，测得值X的标准偏差为：

所以测量重复性引入的标准不确定度为：

表1 试样中维生素B6的测量结果

相对标准不确定度为：

综上所述，由模型式（4）得：

所以考虑重复性后的标准不确定度u（X′）=urel（X′）× X=0.024 9×0.498=0.012 4mg/100mL，取包含因子k=2，则扩展不确定度u（X）=0.024 8mg/100mL，所以扩展相对不确定度为urel（X）=0.024 8/0.498×100=4.98%。该口服液中维生素B6的含量测量结果为X=（0.498±0.024 8）mg/100mL，k=2。各不确定度分量及值见表2。

表2 各不确定度来源、符号及值情况

3 讨 论

3.1 本研究结果显示，供试品峰面积和对照品峰面积即高效液相色谱仪定量重复性引入的不确定度对实验中维生素B6含量测定的不确定度影响贡献最大，在实验中可选择定量重复性状态更佳的仪器，达到降低不确定度的效果。

3.2 除供试品峰面积和对照品峰面积外，其余分量对合成不确定度的影响贡献较小，并且使用较大容量的容量瓶或移液管进行操作可降低不确定度值。

[1]谢琼玉.HPLC法测定赖诺普利片含量及含量均匀度的不确定度评定[J].中国药房，2013，24（40）：3827-3830.

[2]刘亚妮，马林，刘金梅，等.高效液相色谱法测定人血浆中头孢替坦二钠含量的不确定度[J].中国医院药学杂志，2013，33（20）：1695-1698.

[3]苗爱东，王彦宗.高效液相色谱法测定甲硝唑片中甲硝唑含量的不确定度分析[J].解放军医药杂志，2012，24（1）：33-35.

[4]国家质量监督检验检疫总局.JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S].北京：中国标准出版社，2013.

[5]晏彪，郑良荣，陈振云.叶酸、维生素B6对H型高血压高同型半胱氨酸血症的疗效观察[J].心脑血管病防治，2013，13（2）：126-127.

[6]金鹏飞，夏路风，李铮，等.高效液相色谱同时测定多维元素片中的维生素B1、维生素B6、维生素C、烟酰胺和泛酸[J].药物分析杂志，2012，32（9）：1606-1610.

[7]王发，郭欢迎，唐娜，等.HPLC法测定复方醋酸棉酚片中维生素B1和B6的含量[J].安徽医药，2013，17（4）：565-566.

[8]国家质量监督检验检疫总局.JJF 1135-2005化学分析测量不确定度评定[S].北京：中国计量出版社，2005.

[9]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.197 -2003保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.

[10]倪晓丽.化学分析测量不确定度评定指南[M].北京：中国计量出版社，2008：96.

[11]国家质量监督检验检疫总局.JJG196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2007.

Uncertainty evaluation of determ ination of vitam in B6content in oyster soybean peptide carnitine oral liquid by high performance liquid chromatography

Pang Xuebin，ZhangWei，Qiu Yingyuan，Wu Xiaoou
（Shenzhen Quality Standard Research Key Laboratory/Shenzhen DrugsControl Institute，Guangdong 518057，China）

ObjectiveUncertainty evaluation ofdetermination ofvitamin B6 contentin oystersoybean peptide carnitine oral liquid byhigh performance liquid chromatography（HPLCassay）.MethodsHPLCwasadopted for thedetermination ofvitamin B6content.Mathematical modelwas established for the evaluation ofuncertainty to quantize influential factors ofuncertainty and evaluate the uncertainty factors further.ResultsThe contentofvitamin B6in sample oral liquid was0.498mg/100mL，in which，the relative uncertaintyofvitamin B6contentwas0.024 9，the standard uncertaintywas0.0124mg/100mL，theexpanded uncertainty was0.0248mg/100mL（k=2）.ConclusionThe calculationmethod ispracticaland reliable，being access to the uncertainty evaluation of content of vitamin B6in oyster soybean peptide carnitine oral liquid by high performance liquid chromatography.Upon the evaluation，itis found that thequantitative repetitive of the HPLC is themajor impact.

Chromatography，high pressure liquid； Vitamin B6； Oysters； Mathematicalcomputing

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.009

：A

：1009-5519（2015）07-0982-04

2014-09-03

2014-11-07）

庞学斌（1979-），男，广东湛江人，主管药师，主要从事保健食品、化妆品、药品质量标准的研究；E-mail：pangxueb@sina.com。