邻苯二甲酸酯类(PAEs)对三角鲂的急性毒性研究

张威振，赖子尼，赵李娜，王 超，高 原，杨婉玲

(1. 中国水产科学研究院 珠江水产研究所 农业部珠江流域渔业生态环境监测中心 珠江水域渔业生态环境监测与评价功能实验室， 广州 510380； 2. 上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306)

邻苯二甲酸酯类(PAEs)对三角鲂的急性毒性研究

张威振1,2，赖子尼1，赵李娜1，王 超1，高 原1，杨婉玲1

(1. 中国水产科学研究院 珠江水产研究所 农业部珠江流域渔业生态环境监测中心 珠江水域渔业生态环境监测与评价功能实验室， 广州 510380； 2. 上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306)

为了研究邻苯二甲酸酯对水生态系统的危害，以三角鲂(MagalobrameTarminalis)幼鱼为研究对象，探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP) 、邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(DEHP) 、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)4种PAEs化合物对其急性毒性效应。结果表明：以上4种化合物在暴露24 h、48 h 和96 h 的半致死质量浓度( LC50) 分别为2.75、2.41和2.08 mg/L；5.29、4.12和3.29 mg/L；6.56、6.15和5.41 mg/L和6.98、6.84和6.60 mg/L。其安全浓度(SC)分别为0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。三角鲂幼鱼对4种PAEs化合物的中毒症状相似，但4种物质的致死浓度区间存在差别，4种物质对三角鲂幼鱼的毒性大小顺序为DBP>DMP>DEHP>DEP，三角鲂幼鱼对4种PAEs化合物均表现出显著的时间效应和剂量效应，呈正相关。结果表明，4种物质在试验浓度下对三角鲂幼鱼产生了明显的毒性作用，对水生生物存在危害，应对其水生态风险加以关注。为制定4种PAEs水质标准及对其进行生态风险评价提供科学依据。

邻苯二甲酸酯；三角鲂幼鱼；半致死浓度( LC50)；安全浓度(SC)

邻苯二甲酸酯(Phthalate Esters. PAEs)也称酞酸酯，是大约30种化合物的总称，主要作为增塑剂被用于塑料生产[1]。目前，随着塑料制品的大量使用，PAEs对环境的污染也越来越严重，其中邻苯二甲酸二丁酯(Di-n-butyl phthalate，DBP) 、邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate，DMP)及邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(Di(z-etylhexyl) phthalate，DEHP)、邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate，DEP) 4种PAEs化合物已被美国环保局(Environmental Protection Agency，EPA)列入重点控制的污染物名单中[2]。中国也将DMP、DBP列为环境优先污染物[3]。PAEs是一类环境激素[4]，威胁人类健康以及对藻类[5]、浮游生物[6]和鱼类的繁殖、发育产生有害影响[7]。

三角鲂(MagalobrameTarminalis)，主要分布于长江中下游、黄河、黑龙江、珠江及东部沿海诸水系。它体大肉厚、骨刺比较少、肉质嫩滑，可称为淡水鱼类中的珍品。目前，对三角鲂的遗传性状[8]、人工繁殖[9]等方面均有研究，但关于PAEs 类化合物对三角鲂的急性毒性研究尚未见报道。

研究探讨DMP、DEP、DBP和DEHP 4种PAEs 类化合物对三角鲂幼鱼的急性毒性，观察其毒性反应并比较了4种化合物的毒性差异，为PAEs类化合物环境安全性评价及生态毒理学相关研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器及试剂

YSI水质检测仪；电子分析天平；倒置光学显微镜；DMP、DEP、DBP、DEHP标准品(纯度≥98.5%)，购自德国DR公司；助溶剂农乳2201，购自江苏省海安石油化工厂。

1.1.2 实验用鱼

实验鱼购自佛山市南海三角鲂育苗场，在室内喂养1个月，每天早晚各投饵1次，隔天换水，每次换水1/2，自然死亡率<0.1%。平均体长为3.88 cm, 平均全长4.86 cm，平均体重为1.05 g。

1.1.3 实验条件

实验在室内进行，用YSI水质检测仪测得实验水温为18～22 ℃，pH值为7.5～ 8.0，溶氧为5.78～ 6.28 mg/L，总硬度为128 mg/L(以CaCO3计)。玻璃容积规格为60 cm×40 cm×50 cm。

1.2 实验方法

1.2.1 实验采用净水法生物测试

按照《水污染鱼类毒性实验方法》[10]，参考预实验的结果配成5个不同浓度梯度(表1)设置最大助溶剂浓度(受试液中助溶剂体积分数<0.1%)。及空白对照。实验时，每组放入实验鱼15尾，设置3组平行实验。

表1 实验药物的质量浓度

1.2.2 临时装片制作

采用直接盖片法[11]制作临时装片。

首先氨或者尿素等氨基还原剂气化后喷入炉内，或者是先喷入炉内借助烟气热量气化，之后在合适的温度范围（一般称为温度反应窗口）内，气态氨或者尿素等氨基还原剂产生活性分子（NH3或者NH2）经过一系列反应后，氨基活性分子与NOx接触并将其还原成N2和H2O。

1.3 数据处理

用SPSS(14.0)进行数据统计分析。通过质量浓度-死亡率一元回归，计算不同暴露时间下的半致死浓度LC50。并按照公式SC=48 hLC50×0.3/(24 hLC50/48 hLC50)2[10]，求出安全质量浓度。

为评价化合物毒性的强弱，根据鱼类96 h急性中毒试验的半致死质量浓度(LC50)，有毒物质对鱼类的毒性作用标准分为5级[12](表2)。

表2 鱼类急性毒性实验毒性分级标准

2 结果与分析

2.1 实验鱼症状

在以上实验过程中，对照组鱼均表现正常。各物质最高浓度组的鱼先出现水中躁动，向水面窜游，呼吸频率加快，有个别鱼急速旋转游动，一段时间后出现侧泳、乏力，反应迟滞，最后沉于水底死亡症状，直至死亡，死亡鱼体多表现为鳃部充血，身体出现弯曲症状，腹部变淡黄色，体色变暗，个别鱼眼球突出；最低浓度组在短时间内和对照组之间无差别，但随着时间的延长，开始出现中毒症状。三角鲂幼鱼对4种PAEs物质中毒症状类似，但死亡时间及浓度范围存在差异。DBP浓度为4.20 mg/L时，4 h后三角鲂幼鱼出现中毒症状，5 h后出现死亡；DMP浓度为7.50 mg/L时，2 h后三角鲂幼鱼出现中毒症状，5 h后出现死亡；DEHP浓度为8.70 mg/L时，1.5 h后三角鲂幼鱼出现中毒症状，3 h后出现死亡。DEP浓度为10.00 mg/L时，1 h后三角鲂幼鱼出现中毒症状，2 h后出现死亡。

2.2 三角鲂幼鱼在4种PAEs物质各浓度及时间下的死亡率

实验过程中空白对照组死亡率为零，且各平行试验组中死亡个数无明显差别，以下4种PAEs不同暴露时间下的死亡率均采用平均死亡率，各实验组鱼死亡率随着物质浓度的加大而增加；在同一浓度条件下，死亡率随着时间的增加而增加(表3)。

表3 PAEs不同暴露时间下三角鲂幼鱼的死亡率

ANOVA检验结果表明，DBP、DMP、DEHP和DEP各自浓度之间的F值分别为218.42、45.17、33.10和80.02，均远大于F0.01(5.95)且P<0.01，表明不同浓度的4种PAEs化合物对三角鲂幼鱼的致死率均有极显著的影响。DBP、DMP、DEHP各自暴露时间之间的F值分别为17.92、9.42和11.13均大于F0.01(5.95)且P<0.01，表明不暴露时间的4种PAEs化合物对三角鲂幼鱼的致死率均有极显著的影响。而DEP各自暴露时间之间的F值为5.00介于F0.05(3.26)和F0.01(5.95)之间，且0.01

2.3 4种PAEs对三角鲂幼鱼毒性的差异

通过对PAEs质量浓度与三角鲂幼鱼死亡率的回归关系分析得出三角鲂暴露不同暴露时间下的LC50，如表4所示。可得DBP、DMP、DEHP和DEP对三角鲂幼鱼48 h的LC50值分别为2.41、4.12、6.15和6.84 mg/L；安全浓度分别为0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。其中DMP的12 h半致死浓度超出实验设计浓度。

表4可得，多数确定系数(R2)值大于0.90，相关较显著。且三角鲂幼鱼在含4种PAEs化合物的水中暴露后的死亡率和其浓度均呈正相关，其中DBP、DMP的相关性较高。由于DBP、DMP、DEHP和DEP各自浓度之间对三角鲂幼鱼的致死率均有极显著的影响，根据实验所得安全浓度比较三角鲂幼鱼对4种PAEs的安全浓度由小到大顺序DBP、DMP、DEHP和DEP。

表4 PAEs质量浓度与三角鲂幼鱼死亡率的回归关系

x—化合物的浓度；y—实验鱼的死亡率。

2.4 显微观察结果及分析

分别取最高浓度下4种PAEs化合物致死幼鱼的鳃丝做临时装片，在显微镜下(5×40)进行观察，结果如图1。

图1 中毒个体鳃的特征

a—DBP 为4.20 mg/L时5 h中毒鱼鳃; b—DMP 为7.5 mg/L 时5 h中毒鱼鳃; c—DEHP为 8.7 mg/L时3 h中毒鱼鳃; d—DEP 为10.0 mg/L时2 h中毒鱼鳃; e—正常鱼鳃。

由图1发现，实验鱼的鳃部均有明显充血现象，4.20 mg/L DBP和8.7 mg/L DEHP中毒鱼鳃出血最明显。

3 讨论

自20世纪70年代以来就有关于邻苯二甲酸酯类化合物毒性作用的研究和报道，但是过去几十年，人们普遍认为邻苯二甲酸酯类化合物毒性作用较低且具有良好的理化性质，因而大量投入生产和使用。但近年研究表明该类化合物除具一般毒物所具的毒性外，还具有其自身特殊的毒性，如环境激素[4]、致畸、致癌[5]等作用，邻苯二甲酸酯类化合物已经成为环境中重要的有机污染物之一，其生态毒性也越来越被重视。

林玲等[13]研究发现，成年斑马鱼被DBP染毒1个月后，0.062 mg/L的剂量即可导致斑马鱼胚胎发育迟缓，因此，即使在安全浓度之下其慢性毒性亦不容忽视；秦洁芳等[14]研究发现DEHP对红鳍笛鲷幼鱼组织酶活性在试验浓度下影响显著，对水生生物存在氧化胁迫、神经毒性等危害。

Yang等[15]研究了DBP、DMP、DEP和DEHP等化合物对鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)的胚胎毒性试验，得出几种PAEs的毒性大小为DBP﹥DMP﹥DEP﹥DEHP，有研究认为由于DEHP侧链较长，有较高的脂溶性，使其难于渗透到胚胎细胞中，因此出现了毒性相对较低[16]。有报道4种PAEs化合物对绿藻(Selenastrumcapricornutum)的毒性大小为DEHP> DBP> DEP> DMP[17]。何秀婷[18]等根据48 h的LC50得出，4种PAEs化合物对斑马鱼胚胎毒性大小顺序依次为DBP>DEHP>DEP>DMP。Naoki等[19]研究表明，3种PAEs对虾(BrineShrimp)卵的毒性大小为DBP> DEP>DMP。而本研究得出4种PAEs化合物对三角鲂幼鱼急性毒性大小顺序为DBP>DMP>DEHP>DEP。本研究结果显示DBP在96 h三角鲂幼鱼的LC50为2.08 mg/L，与其对斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)96 h的LC50(2.91 mg/L)接近，但低于其对虹鳟(salmogairdner)96 h的LC50(6.47 mg/L)[20]及斑马鱼96 h的LC50(8.51 mg/L)[21]。可见，PAEs对不同水生生物的毒性效应不尽相同。

研究结果表明4种PAEs化合物对三角鲂幼鱼的LC50与暴露时间呈负相关，可推断4种PAEs对三角鲂幼鱼具有一定的累积毒性。随着暴露时间的延长，相邻LC50的差值总体上呈先下降后增加趋势，可推断暴露时间和死亡率呈正相关但其对死亡率影响在一定时间内逐渐减小，当在鱼体累积到一定程度，毒性增强。

鳃是鱼在水体中进行气体交换和离子转移、毒物吸收、生物转化和排泄的重要器官[22]，受毒害时，鳃比其他组织更迅速的积累这些化合物[23]。据此推测，在PAEs较高浓度下，幼鱼通过呼吸，使得化合物被鳃吸附，在鳃中凝结和沉淀，鱼鳃丝卷曲和絮乱，使鳃表面水的摩擦力加大，给气体交换带来困难，使鱼因缺氧死亡。或是因为化合物造成鳃外表皮细胞损伤，血球有溶解，使得细胞调节渗透能力受损，造成鳃丝充血无法正常呼吸而死。具体原因有待进一步研究。虽然国内外学者们对鱼鳃进行了一系列研究，如重金属离子的毒性作用，中毒后重金属离子在鱼鳃中的分布与富集，及由此引起的生理功能的变化等[23]。但对鱼鳃因PAEs引起的毒性研究，目前国内还未见报道。

4 结论

1)DBP、DMP、DEHP和DEP对三角鲂48 h的LC50值分别为2.41、4.12、6.15和6.84 mg/L；安全浓度分别为0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。

2)根据国际上外来化合物对鱼类急性毒性分级标准，以上4种PAEs化合物对三角鲂鱼的半致死浓度均分布在1～100 mg/L之间，毒性等级为高毒性。毒性大小顺序为DBP>DMP>DEHP>DEP。对水生生物产生一定危害，应适当控制PAEs化合物的使用，并对其环境迁移规律及环境生态风险加以关注。

3)不同浓度4种PAEs化合物对三角鲂的致死率都有极显著的影响。而除了DEP暴露时间对三角鲂的致死率未达到极显著水平外，其他3种PAEs化合物的暴露时间对三角鲂的致死率均达到极显著水平。

4)研究结果表明不同种类的PAEs化合物对同种水生生物的毒性效应各有不同，可能同物质结构及生物本身代谢等有关，但PAEs对三角鲂慢性毒性有待进一步探究。

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Acute toxicity study of phthalate esters (PAEs) on theMagalobrameTarminalis

ZHANG Wei-zhen1,2, LAI Zi-ni1, ZHAO Li-na1, WANG Chao1，GAO Yuan1, YANG Wan-ling1

(1. Fishery Eco-environment Monitoring and Evaluation Function Laboratory of Pearl River Valley, Fishery Eco-environment Monitor Center of Pearl River Valley, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380; 2. College of Aquatic and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The purpose of this study is to evaluate the toxicities of PAEs to aquatic ecosystem. TakingMagalobrametarminalisJuvenile as sample，we studied the toxicity of dibutyl phthalate (DBP), dimethyl phthalate (DMP), di-2-ethylhexyl (DEHP) and diethyl phthalate (DEP) onMagalobrametarminalisJuvenile. The results showed that the 24 h, 48 h and 96 h LC50value of four compounds onMagalobrametarminalisJuvenile were 2.75, 2.41 and 2.08 mg/L; 5.29, 4.12 and 3.29 mg/L; 6.56, 6.15 and 5.41 mg/L and 6.98, 6.84 and 6.60 mg/L, respectively. The safe concentrations (SC) of 4 PAEs onMagalobrametarminalisJuvenile were 0.55, 0.79, 1.62 and 2.00 mg/L， respectively. The poisoning symptoms of four kinds of PAEs compounds onMagalobrametarminalisJuvenile were similar, but there were difference among lethal concentration of four kinds of substances. The toxicity of 4 PAEs toMagalobrametarminalisJuvenile was ranked as followed DBP> DMP> DEHP> DEP. Significant time effect and dose effect about four kinds of PAEs compounds onMagalobrametarminalisJuvenile were positively correlated. Results demonstrated that 4 PAEs, which had obvious toxic effects onMagalobrametarminalisJuvenile, were harmful to aquatic organisms, and it should be paid attention to its potential ecological risks on aquatic ecosystem, which can be used as ecosystem risk assessment and 4 PAEs water quality criteria setting.

PAEs;MagalobrametarminalisJuvenile;LC50; SC(Safety concentration)

2014-06-16；

2014-08-20

广东省海洋渔业科技推广专项A201101I02；广西省自然科学重大项目(2013GXNSFEA053003)

张威振，硕士，研究方向为有机污染物残留及风险评价，zwz0725@126.com;

赖子尼，研究员，研究方向为渔业环境保护研究，znlai01@163.com。

R99

A

2095-1736(2015)01-0026-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.026