“从肠论治”对哮喘小鼠BALF炎症细胞及血清IgE含量的影响

刘 妙 郑丰杰 高誉珊 张淑静 张天宇 孙 燕 李宇航

(北京中医药大学基础医学院，北京，100029)

“从肠论治”对哮喘小鼠BALF炎症细胞及血清IgE含量的影响

刘 妙 郑丰杰 高誉珊 张淑静 张天宇 孙 燕 李宇航

(北京中医药大学基础医学院，北京，100029)

目的：观察“从肠论治”对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及血清IgE含量的影响，为探讨“肺与大肠相表里”理论提供实验依据。方法：采用卵清蛋白(OVA)致敏激发方法制备过敏性哮喘小鼠模型，芒硝灌胃刺激，进行小鼠气道反应性试验，肺组织形态学观察，肺支气管肺泡灌洗液细胞分类计数、血清IgE含量检测。结果：与正常组相比，OVA组小鼠气道阻力增加，肺组织出现炎性病理改变，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞总数明显增加，血清IgE含量均明显升高；经芒硝从肠干预后，芒硝组小鼠气道阻力明显降低，肺组织形态结构有一定程度的改善，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞总数明显减少，血清IgE含量显著降低。结论：芒硝刺激大肠，有助于改善气道通气功能，抑制哮喘小鼠气道炎症，改善气道免疫微环境。

从肠论治；肺合大肠；支气管哮喘

支气管哮喘(简称哮喘)是一种以多种反复出现的可逆性气流阻塞和气管痉挛为特征的气道慢性炎症性疾病，以嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞(PMN)、平滑肌细胞、气道上皮细胞等炎性细胞浸润为主要免疫病理改变[1]。IgE主要由呼吸道、消化道黏膜固有层淋巴组织中的B细胞合成，为过敏反应的主要介导因子，其增加与哮喘的触发和严重程度有关[2]。

“肺与大肠相表里”理论是中医脏腑相关理论的重要组成部分，“从肠论治”是在该理论指导下治疗肺系疾病的常用治疗方法之一，即应用具有泻下作用的药物通利大肠以达到治疗肺系疾病的目的。常用的泻下药主要有刺激性泻药和容积性泻药，刺激性泻药主要作用机制是直接刺激肠壁，促进肠蠕动，从而推动粪便排出；容积性泻药的主要作用机制是在肠内形成高渗透压，使水分和食糜容量增大，引起机械性地刺激，使肠蠕动增强而产生排便。本课题组前期研究已经证明，刺激性泻药大黄“从肠论治”，可在一定程度上降低慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠的外周血和肺泡灌洗液中细胞因子含量，减轻全身及局部的炎症反应[3]。为了进一步探讨“从肠论治”的效应机制，我们观察了容积性泻药芒硝对哮喘小鼠气道阻力及肺组织形态结构的影响，并检测了肺泡灌洗液中炎症细胞及血清Immunoglobulin E(IgE)的改变。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物制备 芒硝(Na2SO4·10H2O，中国陕西产)，购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学中医药基础理论与关键技术研究中心鉴定为正品。参文献[4]按人常用量9 g/d折算出小鼠单位体重芒硝的用量为1.0 g/kg。参文献[5]采用传统的温开水溶化的方法制备芒硝药液，参文献[6]采用离子色谱法进行芒硝药液的质量控制。

1.1.2 动物与分组 清洁级、健康、雌性BALB/C小鼠，鼠龄6～8周，体重18～20 g(购于北京维通利华实验动物公司，合格证号:SCXK(京)2007—0001)。适应性喂养7 d后，采用随机数字表法将45只随机分为正常对照组(简称正常组)、哮喘模型组(简称OVA组)和OVA+芒硝组(简称芒硝组)，每组15只。

1.1.3 模型制备 参文献[7]采用OVA(GradeⅤ;Sigma-Aldrich)致敏激发法制备哮喘小鼠模型，即在第1天和第14天，每只小鼠腹腔注射100 μg的OVA与4 mg氢氧化铝混悬液0.1 mL致敏。第21～23天，置于20 cm×30 cm×40 cm的动物雾化箱中，与YC-Y800亚都医用雾化器(YC-Y800,Yadu Corp.，Beijing，China)连接，用3 g/L的OVA溶液雾化吸入激发，每次30 min，每日1次，持续3 d。

实验期间，各组小鼠均常规饲养；第17～23天，芒硝组每天1次给予中药芒硝药液灌胃。用量1.0 g/kg，每天1次，连续7 d。正常组、OVA组分别给予等量蒸馏水灌胃。所有动物在最后1次OVA激发48 h后处死，取材。

1.2 方法

1.2.1 气道激发试验 末次激发48 h后，采用实验小动物肺功能测定仪AniRes 2005 lung function system(Bestlab，AniRes 2005，version 2.0，China)测定气道阻力，每组5只。操作步骤为：0.2%戊巴比妥腹腔麻醉后，行气管切开、气管插管，将小鼠放入密闭的体描箱中，连接小型动物呼吸机行辅助通气，动物呼吸机参数设置为：呼吸频率90次/min，呼吸比为1.5∶1.0，潮气量为6 mL/kg。每只小鼠分别给予逐渐增加的氯化乙酰胆碱(Sigma，US)0.0125、0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg，给药后连续记录5 min。

1.2.2 肺部炎症组织学观察 取小鼠肺组织，用4%的多聚甲醛中性缓冲液灌注固定，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，苏木精-伊红染色(Histology Examination，H&E)染色，每组2只。

1.2.3 肺支气管肺泡灌洗液细胞分类计数 眼球取血后脱颈处死小鼠，剪切开颈部，暴露气管及肺脏，分离气管，结扎一侧主支气管，剪开左侧气管，将导管插入气管内1cm固定，分3次缓慢注入0.9%氯化钠溶液0.4 mL，每次灌洗后立即回收置于离心管中计量，确保回收率在75%以上。将支气管肺泡灌洗液4℃(1000 r/min)离心10 min，取离心后沉淀物涂片，瑞氏染色，进行细胞分类计数。

1.2.4 血清IgE含量检测 采用眼球取血法取血，室温静置2 h后离心分离血清(200 r/min，10 min)，-80°C冷藏。采用ELISA试剂盒检测血清IgE的含量。具体步骤按试剂盒中的说明书进行操作(BD Biosciences，San Diego，CA)。

1.3 数据分析 数据以均数±标准差表示，并采用SPSS 17.0软件进行统计分析，多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；两两比较方差齐者采用LSD(Least-significant difference)检验，方差不齐者采用Dunnett'T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 气道高反应性分析(mean±SD，n=5)

注：Re:呼气阻力。结果以mean±SD表示。与正常组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05。

2 结果

2.1 气道反应性比较 不同浓度氯化乙酰胆碱(ACH)激发后，各组小鼠气道阻力变化见图1。与正常组相比，在ACH浓度为0.0125 mg/kg、0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg时，模型组小鼠气道阻力均明显增加(10.03±2.628 vs 5.06±2.375，18.05±4.379 vs 8.09±4.523，21.21±0.568 vs 10.91±1.981，30.66±7.668 vs 13.47±1.523，104.15±35.225 vs 22.66±3.809)；与模型组相比，经芒硝从肠干预后，在ACH浓度为0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg时，小鼠气道阻力明显降低(12.55±5.965；20.39±7.528；38.84±18.283)。

2.2 组织学观察 H&E染色显示：正常组小鼠肺泡壁结构完整，肺泡上皮细胞排列有序，肺泡壁厚度正常。哮喘模型组小鼠气管壁增厚，褶皱增多，细胞排列杂乱，黏膜下及管周可见以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润。芒硝干预后上述病理改变有所好转(图2)。

图2 哮喘小鼠肺组织病理形态学观察(H&E染色×400)

2.3 肺支气管肺泡灌洗液(Bronchoalverolarlavagefluid，BALF)细胞分类计数 各组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞分类计数结果表明：正常组小鼠BALF中未发现嗜酸性粒细胞，OVA组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞总数明显增加(P<0.01)，经芒硝从肠干预后，芒硝组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞计数明显降低(P<0.01)。与正常组相比，OVA组小鼠BALF中淋巴细胞计数明显增加(P<0.01)；芒硝从肠干预后，芒硝组小鼠淋巴细胞计数明显降低(P<0.05)(表1)。

表1 肺支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数检测 (×104/mL，Mean±SD)

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与OVA组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 各组小鼠血清IgE含量检测(μg/mL)

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与OVA组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 血清IgE含量分析 与正常组相比，OVA组小鼠血清IgE含量均明显升高(5.95±0.249 vs 4.36±0.271，P<0.05)。与OVA组相比，芒硝组小鼠血清IgE含量明显降低(5.38±0.131，P<0.05)。(表2)

3 讨论

哮喘是由多种炎症细胞和炎症递质参与的慢性炎症性气道反应，同时伴有气道高反应性[1]。

中医学“肺与大肠相表里”理论认为，肺与大肠之间存在着某种特异性联系，这种联系在脏器的生理、病理上有着密不可分的依赖关系。肺脏疾病可以影响到大肠[8-9]，大肠病变也可以影响到肺[10-12]。长期的临床实践证实，在慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、急性呼吸窘迫综合征等肺系疾病的治疗中，采用“从肠论治”的方法可有效改善临床症状，提高药物治疗的疗效[13-17]。

本课题组以往的研究证实，以刺激性泻药大黄从肠干预，可以改善COPD模型大鼠气道通气及肺功能[18]，抑制气道重构,改善通气障碍[19]，同时可以减轻肺组织损伤[20]，减轻全身及局部的炎症反应[2]。本试验在此基础上，进一步观察容积性泻药芒硝“从肠论治”的效应机制。

芒硝(Mirabilite)作为容积性泻药的代表药，其主要成分为含水硫酸钠(Na2SO4·10H2O)，溶化或煎汁内服后，硫酸根离子不易被肠黏膜吸收，在肠道内形成高渗溶液，使肠内水分增加，引起机械刺激，促进肠蠕动，从而发生排便反应。中医认为，芒硝具有泻热通便、润燥软坚、清火消肿之功效。《神农本草经》云：“味苦寒，主百病，除寒热邪气，逐六脏积聚，结固留癖，能化七十二种石。”因此，芒硝也是《伤寒论》大承气汤及调胃承气汤发挥泻下作用的主要药物之一。

本研究结果显示，与正常组相比，OVA组小鼠气道阻力明显增加，气管壁增厚，褶皱增多，细胞排列杂乱，黏膜下及管周可见以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润，而芒硝刺激大肠后，模型小鼠气道阻力则显著降低，肺组织形态结构有一定程度的好转，提示经芒硝“从肠论治”可有效改善哮喘模型小鼠气道通气功能，减轻病理改变。此外，OVA组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞显著增多，血清IgE水平显著上升，而经芒硝刺激大肠后，芒硝组小鼠血清中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞总数均明显减少，血清IgE含量明显降低。这表明，基于“肺与大肠相表里”理论，使用容积性泻药芒硝“从肠论治”可以有效抑制哮喘小鼠气道炎症，改善气道免疫微环境，这可能也是其改善哮喘气道通气功能及组织病理改变的机制之一。

综上所述，本课题基于不同肺部炎症疾病动物模型，观察发现不论容积性泻药还是刺激性泻药，“从肠论治”均可对肺部炎症疾病起到一定的治疗作用，这既印证了“肺与大肠相表里”理论，又为进一步研究肺病“从肠论治”的肺-肠联络机制奠定了坚实的基础。

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(2014-12-05收稿 责任编辑：洪志强)

Effect of Relaxing the Large Intestine on BALF inflammatory cell and Serum IgE in Asthma Mices

Liu Miao, Zheng Fengjie, Gao Yushan, Zhang Shujing, Zhang Tianyu, Sun Yan, Li Yuhang

(SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To explore the biological foundation for the TCM theory of the interior-exterior relationship between the lung and the large intestine, we conducted an experiment to evaluate the content of eosinophils and neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and IgE in blood serum after the asthma modeled mice were intervened with mirabilite at large intestines. Methods: Asthma model mice were established by OVA sensitization. Airway responsiveness, histopathology change, classification and counting of the cells of BALF and content of blood serum IgE were observed after large intestine was stimulated by mirabilite. Results: Compared with the normal rats, the asthma model rats' airway resistance increased obviously, the number of eosinophils and neutrophils in BALF and IgE in blood serum significantly increased. After intervened with mirabilite, airway resistance decreased obviously, eosinophils and neutrophils in BALF and IgE in blood serum significantly lowered. Conclusion: Stimulating the large intestine by mirabilite showed beneficial effects in alleviating airway responsiveness and airway inflammation, and improving airway immune microenvironment in asthma mice model.

Relaxing the large intestine; Interior-exterior relationship between the lung and large intestine; Bronchiolar asthma

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(编号：2009CB522704)；北京中医药大学“经方现代应用关键科学问题的基础研究”创新团队(编号：2011-CXTD-04)

刘妙(1986—)，女，博士研究生，研究方向：中医辨证论治规律研究，E-mail：liumiao124@hotmail.com

李宇航，教授，地址：北京中医药大学中医临床基础教研室，北三环东路11号，邮编：100029，电话：(010)64287503，E-mail：liyuhang@bucm.edu.cn

R223.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.006