培养基和植物生长调节剂对青钱柳 悬浮细胞三萜产量的影响

NGUYEN Thi-xuyen 方升佐 NGUYEN Quang-ha范龚健 NGO Anh-son 邓 波

(1.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2.越南北江农林大学森林学院, 北江 236217)



培养基和植物生长调节剂对青钱柳 悬浮细胞三萜产量的影响

NGUYEN Thi-xuyen1,2方升佐1NGUYEN Quang-ha1,2范龚健1NGO Anh-son1,2邓 波1

(1.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2.越南北江农林大学森林学院, 北江 236217)

探讨培养基种类和植物生长调节剂配比对青钱柳悬浮细胞生长、总三萜和三萜单体含量及产量的影响。结果表明:MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT最适合青钱柳悬浮细胞生长，最终产量达到12.03 g/L；WPM+0.5 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L NAA显著提高了青钱柳悬浮细胞中总三萜的含量；青钱柳悬浮细胞中均能检出阿江榄仁酸、青钱柳酸B、齐墩果酸和熊果酸的存在，且阿江榄仁酸和青钱柳酸B含量较高，但基本培养基种类和不同植物生长调节剂组合对悬浮细胞中4种三萜单体含量无显著影响。青钱柳悬浮细胞中总三萜产量以MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA处理最高，而三萜单体产量均以MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT处理最高。

青钱柳； 悬浮细胞;生物量；总三萜；三萜单体；三萜产量

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)系胡桃科青钱柳属植物，是我国特有的单种属植物，为高大速生落叶乔木[1],主要分布于广西、江西、福建、浙江、安徽、湖南、湖北、四川、贵州、河南等地的山区、溪谷或石灰岩山地。青钱柳木材密度比中国传统的枪托用材胡桃楸(Juglansmandshurica)还大，而与优良家具、枪托和机模用材黄杞(Engelhardtiaroxburghiana)很相近[2]。青钱柳作为一种木本药用植物已引起了人们极大的关注,目前已从青钱柳叶中分离出20个单体化合物，鉴定出15个化合物的结构，5个为自然界中发现的新化合物[3-4]，此外，青钱柳叶中还含有丰富的内酯类和黄酮类化合物[5-6]。然而，由植物次生代谢途径生成的有效药用成分的含量较低，且受原料、季节等条件的限制[7]，特别是青钱柳本身繁殖困难，可利用资源匮乏[8]。因此，青钱柳叶用资源难以满足市场需求，研究利用青钱柳细胞培养技术生产黄酮和三萜等次生代谢产物对大规模商业化生产青钱柳重要活性成分具有重要的现实意义。关于细胞悬浮培养技术，国内外已有不少报道[9-11]，但关于青钱柳悬浮细胞培养技术的研究仅见Yin等的报道[12]。本研究分析了培养基种类和植物生长调节剂配比对青钱柳悬浮细胞的生长、总三萜和三萜单体富集的影响，旨在为提高青钱柳悬浮培养细胞的品质和青钱柳悬浮细胞开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1) 青钱柳愈伤组织：由南京林业大学森林资源与环境学院森林培育实验室提供。

2) 继代培养基：以MS培养基为基础，添加1.0 mg/L萘乙酸(NAA)，1.0 mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)，3%蔗糖和0.6%琼脂。

1.2 试验设计及培养条件

1.2.1培养基种类 分析MS培养基、WPM培养基和改良DKW培养基对青钱柳悬浮细胞培养生产三萜的影响。选生长旺盛的愈伤组织2.0 g，接种于100 mL MS培养基、WPM培养基和改良DKW液体培养基上，同时添加1.0 mg/L NAA、0.5 mg/L KT和3%蔗糖。

1.2.2植物生长调节剂配比 在培养基种类研究的基础上，选择悬浮细胞生物产量最高的MS培养基分析不同的植物生长调节剂组合对青钱柳悬浮细胞生产三萜的影响。选生长旺盛的愈伤组织2.0 g，接种于100 mL MS液体培养基上，分别添加植物生长调节剂组合1(1.0 mg/L NAA+ 0.5 mg/L KT)，组合2(0.5 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L NAA)和组合3(1.0 mg/L IBA+ 0.5 mg/L TDZ)作为诱导剂，同时均添加3%蔗糖。

1.2.3培养条件 培养基pH均为6.0，在相对湿度50%～60%，温度(23±2)℃，转速为115 r/min摇床上暗培养10 d，然后进行光培养，光培养7～10 d继代1次。继代时，采用40目不锈钢筛过滤培养物以除去较大的细胞团块，保留分散程度较好的小细胞团和单细胞，按V(过滤后培养液)∶V(新鲜培养液)=1∶2继代培养。经反复继代后建立悬浮细胞系，4个月左右收获细胞置于烘箱烘干进行悬浮细胞生物量、总三萜和各三萜组分含量测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1总三萜含量测定 参考舒任庚等的比色法测定青钱柳中三萜类成分的含量[13],精确吸取齐墩果酸标准母液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0和1.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，待挥干溶剂后，各加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸1.4 mL，然后用乙酸乙酯定容至10 mL，摇匀，在70 ℃水浴中放置15 min，然后在560 nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标，三萜的浓度为纵坐标绘制标准曲线(y=0.517x-0.010 2；R2= 0.993 1)。

将各处理所得的悬浮细胞于60 ℃烘箱中干燥，干燥后碾成粉末。取粉末0.4 g(精确到万分之一)于大试管中，按料液比为1∶30加70%乙醇，在70 ℃条件下超声辅助重复提取3次，过滤合并提取液，在60 ℃水浴中挥发提取液至近干，然后用70%乙醇清洗定容至10 mL。每个配方重复3次，测定总三萜含量。

1.3.2三萜单体含量测定 配制不同浓度的齐墩果酸、熊果酸、阿江榄仁酸和青钱柳酸B标准溶液，采用HPLC法测定青钱柳三萜单体含量。检测器为紫外检测器，进样量为10 μL，洗脱液A为水，洗脱液B为乙腈，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，洗脱顺序为:1) 0～10 min，洗脱剂A 20%+洗脱剂B 80%至洗脱剂A 10%+洗脱剂B 90%梯度洗脱；2) 10～30 min，洗脱剂A 10%+洗脱剂B 90%等度洗脱。

以三萜单体峰面积为纵坐标，三萜浓度为横坐标，制作青钱柳三萜标准曲线，结果如下。

1) 阿江榄仁酸出峰时间3.13 min，标准曲线为：y=5 500.6x-16.679(R2=0.999 4)。

2) 青钱柳酸B出峰时间3.35 min，标准曲线为：y=7 320.5x-9.043 4(R2=0.999 7)。

3) 齐墩果酸出峰时间为10.41 min，标准曲线为：y=5 543.4x-2.737 9(R2=0.999 9)。

4) 熊果酸出峰时间为10.77 min，标准曲线为：y=4 190.4x+4.953 8(R2=0.999 7)。

按照上述方法测定样品中各三萜组分的含量。

1.4 数据分析

试验设3次重复，结果以平均值±标准偏差表示。数据用软件SAS 6.0分析。

2 结果与分析

2.1 培养基种类和植物生长调节剂配比对悬浮细胞生物量的影响

培养基种类和植物生长调节剂配比对青钱柳悬浮细胞干质量的影响结果见图1。

由图1a可知，培养基种类显著影响青钱柳悬浮细胞的产量。MS培养基中青钱柳悬浮细胞生长良好，经继代培养后最终产量达到12.03 g/L，显著高于WPM和改良DKW培养基(P<0.05)；但WPM和改良DKW培养基中的青钱柳悬浮细胞干质量含量差异不显著(P>0.05)。由此可见，MS适合青钱柳悬浮细胞的生长。

植物生长调节剂种类也显著影响青钱柳悬浮细胞的产量(P<0.05)。图1b表明，以MS作为基本培养基时，组合1(1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT)诱导培养获得的青钱柳悬浮细胞干质量最大，组合2(0.5 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L NAA)诱导后获得的青钱柳悬浮细胞干质量次之，组合3(1.0 mg/L IBA+ 0.5 mg/L TDZ)诱导获得的青钱柳悬浮细胞干质量最少，仅为组合1产量的40%左右。

2.2 培养基种类和植物生长调节剂配比对悬浮细胞三萜含量的影响

培养基种类和植物生长调节剂配比对青钱柳悬浮细胞总三萜含量的影响结果见图2。

不同培养基中青钱柳悬浮细胞总三萜含量差异显著(P<0.05)，WPM培养基中总三萜含量显著高于其他2种， MS和改良DKW两者间差异不显著(图2a)。植物生长调节剂组合显著影响青钱柳悬浮细胞总三萜的含量(图2b)。组合2诱导的青钱柳悬浮细胞中总三萜含量最高，达到11.59 mg/g，组合1和组合3间差异不显著。

培养基种类和植物生长调节剂配比对青钱柳悬浮细胞三萜单体含量的影响结果见图3。由图3可知，经3种培养基培养获得的青钱柳悬浮细胞中均检出4种三萜单体。其中，阿江榄仁酸在MS和WPM培养基中均有较高的含量，而在改良DKW培养基中产量较低；青钱柳酸B在3种培养基中含量均较高，达到4.60 mg/g以上；而齐墩果酸和熊果酸在3种培养基中含量均较低。由此可见，青钱柳悬浮细胞培养可以富集阿江榄仁酸和青钱柳酸B，而齐墩果酸和熊果酸的产量较低。

本研究选择的3种植物生长调节剂均能诱导青钱柳悬浮细胞产出4种三萜单体。经组合1培养后，阿江榄仁酸含量显著高于其余2种组合(P<0.05)；青钱柳酸B含量在3种组合诱导培养的悬浮细胞中差异不显著(P>0.05)；齐墩果酸和熊果酸在3种组合诱导培养的青钱柳细胞中含量较低，且三者之间差异间不显著(P>0.05)。由此可见，组合1最适于诱导青钱柳悬浮细胞富集阿江榄仁酸和青钱柳酸B。

2.3 培养基种类和植物生长调节剂配比对悬浮细胞三萜产量的影响

不同培养基种类对青钱柳悬浮细胞培养体系中三萜产量的影响结果见表1。由表1可知，培养基种类显著影响青钱柳悬浮细胞中总三萜的产量，MS培养基中获得的总三萜含量最高，WPM培养基次之，改良DKW培养基最低。培养基种类也显著影响各三萜单体的产量，其对4种三萜单体产量的影响规律同总三萜产量一致。其中，MS培养基中获得的青钱柳悬浮细胞中，4种三萜产量均显著高于其余2种培养基中所获得的产量。

植物生长调节剂配比对青钱柳悬浮细胞培养体系中三萜产量的影响结果见表2。植物生长调节剂配比显著影响青钱柳悬浮细胞中总三萜的产量，组合1和组合2中获得的总三萜产量差异不显著，但均显著高于组合3。植物生长调节剂配比也显著影响各三萜单体的产量，其对4种三萜单体产量的影响规律同总三萜产量一致。其中，组合1中获得的青钱柳悬浮细胞中，4种三萜产量均显著高于其余2种培养基，组合2次之，组合3中获得的4种三萜产量均最低。

表1 不同培养基种类培养下青钱柳悬浮细胞培养体系中三萜产量

表2 不同植物生长调节剂配比下青钱柳悬浮细胞培养体系中三萜产量

3 结论与讨论

培养基种类和植物生长调节剂配比显著影响青钱柳悬浮细胞培养中三萜类化合物的积累。MS培养基有利于青钱柳悬浮细胞的生长，富集阿江榄仁酸和青钱柳酸B，并能获得较高的青钱柳总三萜产量；植物生长调节剂组合2虽然有利于青钱柳悬浮细胞总三萜的富集，但组合1对青钱柳悬浮细胞生长有促进作用，且能够获得最高的总三萜和三萜单体产量。

基础培养基提供植物细胞生长所需的各类物质，而不同科属的植物对营养物质的需求不尽相同，所以在植物细胞悬浮培养时，对培养基的种类要求也不同。本试验选取3种常见培养基，探讨了培养基种类对青钱柳细胞悬浮培养生长和三萜的影响，为青钱柳细胞悬浮培养生产活性物质提供参考依据。本试验发现，青钱柳悬浮细胞在含盐量较高的MS培养基中生长较好，而在WPM中获得的总三萜含量最高。对于旨在生产代谢产物的细胞培养，选择培养基时既要考虑有利于细胞生长的培养基，也要考虑有利于目的产物积累的培养基。杨芳[14]研究发现，MS培养基虽有利于丹参悬浮细胞的生长，但是6,7-V培养基更利于丹参酚酸的合成积累，因此，综合考虑应选择6,7-V培养基作为丹参悬浮细胞培养基。本研究结果显示，青钱柳悬浮细胞产量在MS培养基上生长最高达到12.03 g/L；总三萜含量在WPM培养基上效果最好；青钱柳悬浮细胞三萜单体中阿江榄仁酸在MS和WPM培养基中产量最高，在改良DKW培养基中产量较低；青钱柳酸B在3种培养基中含量较高，均达到4.60 mg/g；而齐墩果酸和熊果酸在3种培养基中含量较低。

培养基的类型、碳源种类、植物生长调节剂种类及质量浓度、接种量、装液量、初始pH及摇床转速等因素均能影响细胞生长。其中，植物生长调节剂对细胞生长具有重要的调控作用，选择合适的植物生长调节剂配比对促进细胞的生长具有重要作用。本研究发现：NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L的组合对青钱柳悬浮细胞的含量效果最大；而2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L的组合总三萜含量最高；NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L的组合显著提高阿江榄仁酸含量，2，4-D 0.5 mg/L +NAA 0.3 mg/L和NAA 1.0 mg/L+ KT 0.5 mg/L的组合有利于青钱柳酸B含量累积。NAA 1.0 mg/L + KT 0.5 mg/L的组合最适于青钱柳悬浮细胞富集阿江榄仁酸和青钱柳酸B。总体看，生长素对青钱柳悬浮细胞生长的影响要大于细胞分裂素。

植物细胞悬浮培养时，细胞起始密度对悬浮细胞生长影响较大。因为植物细胞间的联系通常比微生物细胞的联系密切得多，细胞要维持分裂和生长，其内源代谢物质必须达到一定的阈值，在有较高密度细胞群和培养基营养丰富的情况下，易于达到这种阈值。但如果接种密度过大，可能引起氧和营养物质的传输受限，导致细胞衰竭[15]。不同植物所需的起始密度各不相同。韦晓新等[16]研究表明，30 g/L(鲜质量)的接种量适合于铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)原球茎的生长；陈书安等[17]研究表明，在接种量为5%时，藏红花(Crocussativus)悬浮细胞生物量达到最高。关于接种量对青钱柳悬浮细胞生长的影响有待于今后进一步探讨和研究。

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(责任编辑 张 坤)

Effects of Culture Mediums and Plant Hormones on Triterpenoid Production in the Cell Suspension Culture ofCyclocaryapaliurus

NGUYEN Thi-xuyen1,2,FANG Sheng-zuo1,NGUYEN Quang-ha1,2,FAN Gong-jian1, NGO Anh-son1,2,DENG Bo1

(1.College of Forestry, Nanjing Forestry University,Nanjing Jiangsu 210037,China; 2.College of Forestry,Vietnam Bac Giang University of Agriculture and Forestry,Bac Giang 236217, Vietnam)

Effects of basic culture mediums and plant hormones on suspension cell growth,contents and productions of total triterpenes,oleanolic acid,ursolic acid,arjunolic acid and cyclocaric acid B in the cell suspension culture ofCyclocaryapaliuruswere investigated in this study.The results showed that MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT were most suitable for suspension cell growth ofC.paliurus,and ultimately production reached 12.03 g/L.WPM+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA significantly improved total triterpenoid content in the suspension cells.Arjunolic acid,paliurus acid B,oleanolic acid and ursolic acid were detected in all the suspension cells,but the content of arjunolic acid and paliurus acid B was much higher than the others.However,basic culture mediums and plant hormones did not significantly affect the content of oleanolic acid,ursolic acid,arjunolic acid andcyclocaric acid B in the suspension cells.The greatest production of total triterpenoids was achieved in MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA, while the highest yield of different triterpenoid monomers was observed in MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT.

Cyclocaryapaliurus;suspended cell;biomass;total triterpenoids;triterpenoid monomer;triterpenoid production

2014-06-13

国家自然科学基金项目( 31270673)资助；江苏高校协同创新计划“南方现代林业协同创新中心”资助；江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)资助。

方升佐(1963—)，男，教授，博士生导师。研究方向：森林培育。Email:fangsz@njfu.edu.cn。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.01.002

S723.1

A

2095-1914(2015)01-0006-06

第1作者：NGUYEN Thi-xuyen(1978—)，女，博士。研究方向：森林培育。Email:1727573169@qq.com。