雪莲中绿原酸、芦丁、木犀草素含量的HPLC法测定

张海霞 卢永昌 王庶

摘要：建立测定雪莲（Saussurea involucrata）中绿原酸、芦丁和木犀草素含量的方法，采用HPLC法，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.8%磷酸水溶液进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长360 nm，柱温30 ℃。绿原酸、芦丁、木犀草素的线性范围分别为0.081～0.408 μg/mL、0.090～0.449 μg/mL、0.045～0.224 μg/mL;平均加样回收率分别为99.78%、99.89%、100.70%，其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高，木犀草素在苞叶雪莲中含量最高。

关键词：高效液相色谱法（HPLC）;雪莲（Saussurea involucrata）;绿原酸;芦丁;木犀草素

中图分类号：R284.2;S567        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0434-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.045

Determing Chlorogenic Acid， Rutin and Luteolin in Saussurea Involucrate of Three Varieties with HPLC

ZHANG Hai-xia1，LU Yong-chang2，WANG Shu1

（1.College of Life Science and Chemistry，Qinghai University for Nationalities， Xining 810007， China;

2.Key Laboratory of Chemical， Qinghai-Tibet Plateau Plants Resources，Xining 810007， China）

Abstract： To establish a method for determining chlorogenic acid， rutin and luteolin in Saussurea involucrate， the Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm， 5μm） column was used. The mobile phase was consisted of acetonitrile and 0.8% aqueous phosphoric acid with gradient elution.The flow rate was 1. 0 ml·min-1 and the detective wavelength was 360 nm. The column temperature was 30℃. The peak areas and concentrations of chlorogenic acid， rutin and luteolin had good correlation in the ranges of 0.081～0.408μg/mL，0.090～0.449μg/mL and 0. 0448～ 0.224μg/mL， with the average recovery rates of 99.78%，99.89% and 100.70%， respectively. The contents of chlorogenic acid and rutin were the highest in Saussurea involucrata（Kar. et Kir.） Sch.-Bip. Saussurea obov-allata （DC.） Edgew had the maximum content of luteolin.

Key words：HPLC; Saussurea involucrata （Kar. et Kir.） Sch.-Bip.; chlorogenic acid; rutin; luteolin

雪莲（Saussurea involucrata）又名雪荷花，为菊科（Asteraceae）凤毛菊属（Saussurea）植物，珍稀名贵中药材，常见的有苞叶雪莲、水母雪莲、天山雪莲、唐古特雪莲等，主要分布在2 400 m以上的高原寒带地区的青海、新疆、甘肃、四川、西藏等地。雪莲性温、微苦，祛风除湿，通筋活血，暖宫散瘀效果显著。此外，对风湿性疾病具有特殊效果，还具有抗炎镇痛、止血消肿之功效，使用安全，无明显的不良反应[1-3]。药理研究显示芦丁、木犀草素和绿原酸为雪莲中的主要抗肿瘤抗癌有效成分[4-6]。对于芦丁、木犀草素和绿原酸在雪莲中的含量同时分析测定尚未见报道。为有效控制雪莲药材质量，本试验采用微波提取法对雪莲中芦丁、木犀草素和绿原酸进行提取，采用高效液相色谱法对芦丁、木犀草素和绿原酸的含量进行了测定，并比较了不同种雪莲药材3种物质的含量差异。该方法快速、简便、准确、重复性好，为雪莲药材的进一步研究和综合开发利用提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料与仪器

雪莲系2012年8月采自青海、新疆（经高原生物研究所胡凤祖副研究员鉴定）。

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括G1311A四元输液泵，G1316A柱温箱，G1329A自动进样器，G1315A二级管阵列（DAD）检测器，Agilent1200色谱工作站。

1.2  试验试剂

芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）、绿原酸标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200212）和木犀草素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：111520-200504）;乙腈，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯;水为超纯水。

1.3  色谱条件

色谱柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）; 流动相乙腈（A）-0.8% 磷酸水溶液（B） ，梯度洗脱（0～8 min，10%～15% A;8～12 min，15%～30%A;12～35 min，30%～32% A）;检测波长360 nm;流速为1.0 mL/min;进样10 μL，柱温30 ℃。

1.4  溶液的配制

1.4.1  标准品溶液制备  分别精密称取绿原酸 10.20 mg、芦丁 11.23 mg、木犀草素5.60 mg，置于 50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为204.0、224.6、112.0 mg/L的标准品储备液。

1.4.2  供试品溶液的制备  精密称取雪莲药材粉末1.30 g，置具塞锥形瓶中，精密加入纯甲醇40 mL，超声波处理2 h，冷却，再称定重量，用纯甲醇补足减失重量，0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2  结果与分析

2.1  系统适应性试验

分别吸取标准品溶液和供试品溶液，按“1.3”的色谱条件，分别进样10 μL，记录色谱图。结果表明在此色谱条件下，绿原酸、芦丁、木犀草素分离良好，分离度均大于1.5，且理论塔板数均不低于4 000，结果见图1至图4。

2.2  线性关系考察

精密吸取上述标准品储备液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，配成系列质量浓度的标准品溶液。取10 μL进样后记录峰面积，以质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得到绿原酸、芦丁、木犀草素的回归方程。

绿原酸：Y=12 316X+99.5（r=0.999 9）

芦丁：Y=11 276X+246.5（r=0.999 7）

木犀草素：Y=22 277X+20.8（r=0.999 5）

结果表明，绿原酸、芦丁、木犀草素分别在0.081～0.408、0.090～0.449、0.045～0.224 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.3  稳定性试验

用自动进样器依次对同一供试品溶液进样，在1、 2、3 d后分别进样10 μL，以峰面积计算。结果表明，绿原酸的RSD为1.23%，芦丁的RSD为1.35%，木犀草素的RSD为1.30%，供试品溶液在3 d内稳定。

2.4  精密度试验

按“1.3”的色谱条件，绿原酸，芦丁和木犀草素的标准品溶液各进10 μL，每种溶液测定6次，记录峰面积，绿原酸RSD为0.88%，芦丁RSD为1.18%，木犀草素RSD为1.22%，表明进样精密度良好。

2.5  重复性试验

精密称取水母雪莲粗粉（过100目）6份，按“1.4.2”制备样品溶液，用“1.3”的色谱条件，进样分析，记录峰面积，绿原酸的RSD为0.89%（n=6），芦丁的RSD为0.89%（n=6），木犀草素的RSD为1.11%（n=6）。

2.6  加样回收试验

取已知绿原酸、芦丁和木犀草素含量的雪莲9份，分别在上述9份药材中加入绿原酸的标准品溶液（0.204 mg/mL）、芦丁标准品溶液（0.225 mg/mL）和木犀草素标准品溶液（0.112 mg/mL），按“1.4.2”制得供试品溶液，分别进样10 μL，记录雪莲中绿原酸、芦丁和木犀草素的峰面积，计算含量，并计算回收率，结果见表1。

2.6  样品测定

按“1.3”的色谱条件，分别精密称取3种雪莲药材粉末各1 g，按上述方法测得绿原酸质量分数为0.132 1%～0.193 3%，平均为0.160 7%（n=8）;芦丁质量分数为0.113 4%～0.202 2%，平均为0.171 2%（n=8）;木犀草素质量分数为0.020 4%～0.058 2%，平均为0.036 1（n=8），其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高，木犀草素在苞叶雪莲中含量最高（表2）。

3  小结与讨论

雪莲中所含成分复杂，其理化性质相差较大，表现出较大的色谱行为差异。目前文献报道的多组分含量测定方法不甚理想，多有拖尾现象。考虑到绿原酸与芦丁2组分均具酸性，笔者通过调节流动相的pH，以抑制样品组分的解离，较好地改善了峰形[7]。同时，三者的极性差异较大，为了使各组分有较好的分离效果，采用梯度洗脱技术[8，9]。先后使用不同比例的甲醇、甲醇-磷酸、乙腈、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等，分离效果均不显著，分离度不达标，采用乙腈-0.8%磷酸水溶液梯度洗脱后，拖尾情况有较好改善，图谱特征性增强，目标峰的峰型和分离度均较好，故选择乙腈-0.8%磷酸水溶液为流动相[6]，用于梯度洗脱。

通过对3种雪莲样品中3种药效化合物的含量进行测定，结果表明，不同种雪莲有效成分含量有差异：木犀草素在苞叶雪莲中含量最高;绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高。可见，品种基因影响了药材有效成分的积累，根据有效成分的含量确定药材的品种是非常必要的，为今后雪莲的开发应用提供了必要的信息。

参考文献：

[1] 庄  丽，李卫红，孟丽红.新疆雪莲资源的利用、研发与保护[J].干旱区资源与环境，2006，20（2）：195-201.

[2] 谢宗波，姜国芳.雪莲化学成分及药理作用研究进展[J].食品科技，2010，29（5）：438-440.

[3] 袁晓凡，赵  兵，王玉春.雪莲的研究进展[J].中草药，2004，35（12）：1424-1426.

[4] 张伟敏，张盛林，钟  耕.木犀草素的研究概况[J].中国食品添加剂，2005，6（2）：11-15.

[5] 陈绍华，王亚琴，罗立新.天然产物绿原酸的研究进展[J].食品科技，2008，4（2）：195-198.

[6] 陈  勇，李艳苓，李  立，等.HPLC法测定山绿茶不同炮制品种中绿原酸和芦丁的含量[J].广西科学院学报，2006，22（4）： 416-418.

[7] 董建辉，华  卡.高效液相色谱法同时测定天山雪莲中绿原酸和芦丁的含量[J].中南药学，2007，5（4）：333-335.

[8] 刘海芳，魏东伟，刘全军，等.太行菊不同器官中绿原酸和4种黄酮类物质含量研究[J].天然产物研究与开发，2013（5）：646-651，671.

[9] 刘尤岩，周文芳，王玉忠，等.高效液相色谱法分离测定雪莲细胞中的黄酮[J].药物分析杂志，2005，25（l）：40-43.