斑马鱼SAA蛋白原核表达、抗体制备及菌结合试验

齐麟 李军 向志明 余英才

4.江西中医药大学生物化学教研室，南昌  330004）

摘要：通过构建斑马鱼（Danio rerio）SAA原核表达载体，在大肠杆菌（E.coli）TB1中诱导表达并纯化获得了斑马鱼SAA融合蛋白，将纯化的斑马鱼SAA蛋白免疫Balb/c小鼠，制备了特异性多克隆抗血清，并研究了斑马鱼SAA融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明，纯化的斑马鱼融合SAA蛋白能够与5种细菌直接结合，血清效价达到1∶2 000以上。

关键词：斑马鱼（Danio rerio）;血清淀粉样蛋白A;原核表达;抗体制备;菌结合

中图分类号：Q789        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0382-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.031

Prokaryotic Expression， Antibody Preparation and Bacteria Combining of

SAA Protein in Zebrafish

QI Lin1，LI Jun2，XIANG Zhi-ming3，YU Ying-cai4

（1.Railway Police College， Zhengzhou 450053， China; 2. School of Pharmaceutical， Liaocheng University， Liaocheng 252000， Shandong， China; 3.South China Sea Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510301， China;

4.Department of Biochemistry Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

Abstract： The SAA fusion protein in zebrafish（Danio rerio） was expressed in E.coli TB1 and purified according to the construction of prokaryotic expression vector. The specific polyclonal antibodies were raised in Balb/c mouse immunized with the purified recombinant protein. The bacteria conjugation ability and the value of polyclonal antibodies were detected. The results showed that the purified SAA protein in zebrafish was found to combine together with 5 bacteria. The value of obtained antibodies was up to 1∶2 000.

Key words： zebrafish（Danio rerio）; SAA; prokaryotic expression; antibody preparation; bacteria combining

血清样淀粉A（Serum amyloid A， SAA）为高度异质性蛋白[1]，因与一系列疾病相关而成为病理学研究的热点。SAA基因的多态性是淀粉样病变的高危因素，持续高水平SAA是淀粉样病变发生的前提条件[2]。除此之外，SAA与胃癌[3]、直肠癌[4]、胰腺癌[5]、肺癌[6]和绒毛膜癌[7]等恶性肿瘤呈正相关，并将SAA作为癌症临床常规检查的非特异性肿瘤标志物以及手术后康复程度的指标是可行的。人源SAA可以通过NF-κB信号通路诱导细胞间黏附分子1（Intercellular adhesion molecule 1， ICAM-1）的表达而募集白细胞[8]。本研究中在克隆获得全长斑马鱼（Danio rerio）SAA的基础上[9]，构建融合表达载体，在大肠杆菌TB1中表达斑马鱼SAA并进行纯化，将纯化蛋白进行菌结合试验并免疫Balb/c小鼠制备了特异性多克隆抗体，为后续免疫及肿瘤病理学试验打下基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  载体与菌种  原核表达载体pMal-c2x、大肠杆菌（E. coli）表达宿主菌TB1和Amylose Resin多糖树脂购自New England Biolabs公司;pGEM-T vector购自Promega公司;大肠杆菌DH5α、野生型大肠杆菌K12、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶澡酸弧菌（V.alginolyticus）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）和表皮葡萄球菌（S.epidermidis）均为铁道警察学院生化快速鉴别实验室常规保种。

1.1.2  试剂  琼脂糖胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒为Omega公司产品;T4 DNA连接酶、Taq酶、DNA marker、限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ为宝生物工程（大连）有限公司产品;蛋白Marker为Fermentas公司产品;碱性磷酸酶羊抗鼠IgG购自美国安玛西亚公司;NC膜购自PALL公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2  原核表达载体pMal-c2x-SAA的构建

使用Primer premier 5.0软件设计上、下游引物，以pGEM-T-SAA为模板进行PCR扩增，其中上游引物序列：5′-TTTGAATTCATGAAGCTTCTTCTTG -3′，下游引物序列：5′-TTTTCTAGATATGGGCAGG

CCTTTA-3′。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环;72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后和pMal-c2x空载体质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后于16 ℃连接过夜，并将连接产物转化原核表达宿主菌TB1，-80 ℃保菌。

1.3  重组质粒pMal-c2x-SAA的诱导表达及纯化

取“1.2”中的菌液0.5 mL接种到5 mL含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃过夜培养后，转接到500 mL的新鲜培养基中，继续37 ℃培养至OD600 nm=0.6，加入0.1 mmol/L的IPTG诱导3 h以上，以12%的SDS-PAGE电泳分析其表达后利用Amylose Resin多糖树脂来纯化重组蛋白。

1.4  斑马鱼SAA蛋白的菌结合试验

将获得的斑马鱼SAA纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献[10]。

1.5  斑马鱼SAA蛋白抗鼠血清制备

取100 μg纯化的斑马鱼SAA融合蛋白进行SDS-PAGE，切下目的蛋白质条带，以去离子水反复漂洗，去除凝胶上的甲醇和冰醋酸，以pH 7.4的PBS缓冲液4 ℃浸泡过夜。于冰浴中用研钵研磨直至悬浮液中的凝胶颗粒细小而均匀，加入等体积的弗氏佐剂，继续研磨或用注射器反复抽打使完全乳化。将1 mL用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液通过腹腔注射接种发育良好的纯种Balb/c小鼠体内做为基础免疫，基础免疫后14 d进行加强免疫。注射间隔周期为7 d，加强注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐剂进行乳化。加强免疫4次后采用传统摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液37 ℃保温1 h后，4 ℃静置过夜，5 000 r/min离心10 min后，取上清-80 ℃分装保存。

1.6  斑马鱼SAA蛋白抗鼠血清效价的测定

用PBS缓冲液将抗鼠血清进行稀释，稀释梯度依次为1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000。取NC膜用PBST缓冲液浸泡5 min， 晾干，取纯化的蛋白1 μg点于膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST 缓冲液37 ℃封闭1 h，PBST缓冲液洗涤10 min（重复3次）;将膜分别用封闭液稀释的抗血清37 ℃孵育1 h，PBST缓冲液洗涤10 min（重复3次）;用羊抗鼠IgG为二抗，37 ℃哺育1 h，PBS缓冲液洗涤10 min（重复3次），DAB显色。

2  结果与分析

2.1  原核表达载体pMal-c2x-SAA的构建

使用载体构建的特异性引物进行菌落PCR扩增，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。由图1可以看出，挑选的5个克隆中有4个大小约360 bp，与预期大小相符，表明成功构建pMal-c2x-SAA原核表达载体。

2.2   SAA蛋白的表达与纯化

将融合表达载体pMal-c2x-SAA质粒转化到 E.coli菌株TB1，用0.1 mmol/L 的IPTG 37 ℃分别诱导3、6 h后，菌体用12%的SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示。由图2可以看出，在53 ku附近有明显的蛋白条带出现，与预期大小相同，并利用Amylose Resin多糖树脂来纯化了重组蛋白，获得较为专一的蛋白条带。

2.3  斑马鱼SAA蛋白菌结合试验结果

使用纯化的SAA融合蛋白与3种革兰氏阴性菌（野生型大肠杆菌K12、副溶血弧菌、溶澡酸弧菌）以及2种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）分别进行结合试验，以诱导pMal-c2x空载体获得的融合蛋白为对照，结果如图3所示。斑马鱼SAA具有广谱的菌结合能力，与上述5种细菌都能结合。

2.4  斑马鱼SAA抗小鼠多克隆抗体效价的测定结果

取纯化后的重组斑马鱼SAA蛋白对小鼠进行皮下免疫，经过4次免疫后，从兔子耳静脉取血制备血清，用斑点酶联免疫吸附试验（DOT-ELISA）测定抗血清效价。由图4可知，鼠抗斑马鱼SAA血清的效价达到1∶2 000以上。

3  小结与讨论

斑马鱼SAA蛋白具有广谱的菌结合能力，对本试验所选取的5种细菌均表现出很强的吸附能力。哺乳动物SAA蛋白一般只能对革兰氏阴性菌有结合能力，对革兰氏阳性菌无结合能力。哺乳动物的免疫系统比鱼类复杂得多，对不同种类的细菌表现出不同的免疫机制。斑马鱼属于进化地位较低等脊椎动物，SAA蛋白可能担负起对整个细菌的识别，而在哺乳动物中，SAA蛋白功能可能被弱化和部分分离，进化压力胁迫对SAA蛋白功能产生了较大的影响。

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