罗田甜柿种质资源ISSR分子标记初步鉴定

程华 陈小玲 李琳玲 程军勇 邓先珍 张雪花 黄兵杰 程水源

摘要：分别采集湖北省罗田县、麻城市自然分布的28、8株罗田甜柿（Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）古树优系及小涩柿、无核、宝盖、秋焰甜柿优系为研究材料，利用简单重复序列间扩增分子标记（Inter simple sequence repeat，ISSR）技术对40个甜柿优系进行初步认证及亲缘关系分析。结果表明：①从21条ISSR引物中筛选出了9条能够扩增出清晰、稳定条带的引物，9条引物共扩增出185条谱带，其中多态性条带有185条，多态性条带比率为100%;②应用NTSYS2.10e软件对扩增结果进行非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚类分析，40个甜柿优系大致被分为两大类，遗传相似系数从0.39到0.92;③罗田甜柿古树基因资源丰富，每个基因型都有其独特的指纹图谱，遗传多样性高。罗田甜柿优系间的亲缘关系与地理来源有一定的相关性，麻城市与罗田县地理位置交界区域的罗田甜柿资源相对集中在A区，其他地理位置采集优系集中在B区。分析结果可为罗田甜柿种质资源开发、基因资源保存、后期品种审定及鉴别提供理论依据。

关键词：罗田甜柿（Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）;简单重复序列间扩增分子标记;种质资源;鉴定

中图分类号：S665.2;Q75;S602.4        文献标识码：A       文章编号：0439-8114（2015）02-0370-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn 0439-8114.2015.02.029

A Preliminary Identification of the Genetic Resources of Luotian Sweet Persimmon

with ISSR Markers

CHENG Hua1，CHEN Xiao-ling1，LI Lin-ling1，CHENG Jun-yong2，DENG Xian-zhen2，ZHANG Xue-hua1，

HUANG Bing-jie1，CHENG Shui-yuan1

（1. Huanggang Normal University，College of Life Science/Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratories，Huanggang，438000，Hubei，China;2.Hubei Academy of Forestry，Wuhan 430075，China）

Abstract： The genetic resources of 28 Luotian sweet persimmon （Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon） with ancient major clique and 8 samplea from Luotian county， Macheng city of Hubei province were analyzed with Inter simple sequence repeat （ISSR） markers. Xiaoseshi， Wuhe， Baogai and Qiuyan were used for screening primers. The results shows that 9 dolymorphic primers were screened from a total of 21 ISSR ones. The genomic DNAs of 40 varieties were amplified to obtain a total of 185 bands， with polymorphism rate of 100%. 40 persimmon major cliques were devided into two categories by Unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis， using NTSYS2.10e software. The genetic similarity coefficient was ranged from 0.39 to 0.92. Luotian sweet persimmon trees had abundant genetic resources with genetic diversity. It will provide a theoretical foundation for identifying Luotian sweet persimmon cultivars， and effectively utlizing germplasm resources.

Key words： Luotian sweet persimmon （Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）; Inter simple sequence repeat; germplasm resources; identification

柿（Diospyros kaki Thunb）是我国五大木本粮油树种之一，其果实、果蒂和叶片富含维生素C、多糖、碘、单宁等营养成分[1]，可广泛应用于食品、药品、饮料等工业领域。作为世界上惟一自然脱涩的甜柿品种罗田甜柿（D. kaki cv. Oriental persimmon）在湖北省罗田县已有千余年的栽培历史。现在罗田甜柿是中国地理标志产品，种植面积已发展到0.24万hm2，年产甜柿0.6万t，鲜果收入达1.44亿元，是罗田县极具发展潜力的木本粮油产业之一[2]。

柿种内的变异极为丰富，芽变品种多，所以品种间的亲缘关系不明析，严重影响了柿资源的推广、育种亲本的选配和栽培立地条件的选择[3]。由于传统的植物形态鉴定存在时效性较差、容易受到环境与主观因素的影响等特点，难以进一步弄清罗田甜柿种质资源的亲缘关系。因此，利用分子标记技术结合形态鉴定手段是理顺罗田甜柿亲缘关系的有效途径。简单重复序列间扩增（Inter simple sequence repeat，ISSR）分子标记是类似随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）标记的一种聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术[4]，是近几年来在微卫星（Microsatellite）分子标记基础上发展起来的一种新型分子标记技术[5];ISSR标记能有效揭示种群内的遗传多样性，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传结构及其多样性程度[6]。然而ISSR技术极易受模板、引物以及Taq酶等因素的影响，任何一个因素的改变都可能使扩增产物发生变化。为此需要对甜柿ISSR分子标记的反应体系进行优化，使反应结果更加精准。试验选用ISSR技术探讨了罗田甜柿古老优树种质资源的基本情况，以期能够更快速、准确、简便地鉴定这些古老优树间的亲缘关系，从分子学水平上为罗田甜柿种质资源的收集、鉴定和发展利用提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料  罗田甜柿植物材料为湖北省罗田县不同乡镇的古老优树28个样品，以麻城市不同乡镇的8个样品作为参照，用罗田县农家品种无核（W）、宝盖（B）、小涩柿（S）、秋焰（Q）为筛选引物提供参考。每个样品随机选取10～20片幼嫩叶片，田间采叶后装入做好标记的自封袋中，迅速送到黄冈师范学院经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，于-80 ℃冰箱中冷冻保存。材料来源和编号见表1。

1.1.2  主要试剂  琼脂糖、5×TBE缓冲液、2×Taq PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司;CTAB提取DNA试剂、30%聚丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸等购自武汉贝尔生物技术有限公司;Maker DL2000购自大连宝生物工程有限公司。

1.2  方法

1.2.1  罗田甜柿基因组DNA的提取与检测  试验参考梁玉琴等[7]的CTAB法，略做改进，提取40个罗田甜柿优系叶片的总基因组DNA。在0.8 %的琼脂糖凝胶电泳中检测所提取基因组DNA的质量，紫外分光光度计检测DNA的浓度，提取的总DNA保存于-20 ℃冰箱中，备用，-4 ℃为短期存放条件。

1.2.2  引物来源及ISSR-PCR扩增反应体系的建立  试验所用引物是依据柿的EST文库筛选出的ISSR序列，参照加拿大哥伦比亚大学网站公布的ISSR引物序列，共设计出21条扩增引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ISSR-PCR扩增反应体系为20 μL，包括2×Taq PCR MasterMix反应液（0.1 U/μL Taq Polymerase、500 μmol dNTP each、20 mmol Tris-HCl、100 mmol KCl、3 mmol MgCl2 及其他稳定剂和增强剂）10 μL，引物2 μL，DNA模板50 ng，ddH2O 加至20 μL。扩增程序设为94 ℃预变性3 min;然后94 ℃变性30 s，50～56 ℃退火40 s，72 ℃ 3 min，共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3  引物筛选  选用基因组DNA纯度较高的罗田甜柿样品为模板，分别对21个引物采用以上扩增程序进行PCR扩增。扩增产物先用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测，再用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析，筛选出的多态性较高的引物用于40个罗田甜柿样品的鉴定。

1.3  统计与分析

将扩增的PCR产物全部上样6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，在350 V电压下电泳约140 min，经硝酸银染色、氢氧化钠显影，所获得的扩增条带以0、1统计建立数据库。条带统计以其清晰可重复为基本原则，采用人工读带法，在相同迁移位置上有带记为1、无带记为0。在NTSYS 2.10e分析软件中，根据SM相似系数法求得品种间的遗传相似性矩阵，再用非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）进行聚类分析，构建系统聚类分析树状图[8]。

2  结果与分析

2.1  引物筛选结果

随机选取秋焰的DNA为模板，分别对21条ISSR扩增引物进行筛选，淘汰无扩增产物和多态性差的引物，选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物，结果见图1。根据琼脂糖电泳得到的初步检测结果，结合聚丙烯酰胺电泳（图2）结果的进一步分析，从中筛选出了9个引物，具体见表2。分析可见，这些引物均能在供试罗田甜柿样品中扩增出清晰、稳定、重复性和多态性较高的条带。如图1结果显示，在泳道2、3、5、7、9、11、13、14、15、17、18、20、21中均有多态性条带，说明对应编号的引物都可为ISSR引物筛选提供参考，因此对其他泳道没有显示多态性条带的引物予以淘汰。图2显示，泳道2、3、5、7、9、11、13、14、15、17、18、20、21的多态性条带数清晰，再结合图1初步筛选的结果，确定9条引物（表2）用于40个罗田甜柿优系的认证和鉴定。

2.2  ISSR多态性分析及指纹分析

用筛选出的9个引物分别对40个罗田甜柿样品提取的基因组DNA进行PCR扩增，经统计，共扩增出185条DNA条带，其中多态性条带185条，平均每个引物扩增出20.1个条带，平均多态性位点率为100%，具体结果见表2。从表2可见，不同引物扩增出的条带数有较大的差异，如引物ISSR3、ISSR21扩增出的条带较多，分别为29、27条，而引物ISSR7扩增出的条带数最少，仅有14条。从表2还可见，所选择的引物多态性达100%。9条引物能分别建立相应的DNA指纹图谱（因为图多，文中省略），由各引物扩增效果所反映出的DNA条带多态性能较好地区分开各个罗田甜柿的优系。

2.3  罗田甜柿优系间的遗传相似性分析

用NTSYS2.10e软件计算甜柿优系间的Dice遗传相似系数，结果见表3。由表3可知，40个罗田甜柿优系间的遗传相似系数范围为0.39～0.92，平均遗传相似性系数为0.71。以罗田县平湖乡东冲畈村在海拔148 m处采集的1号优系样品和从罗田县大崎乡平头岭村海拔588 m处采集的9号优系样品遗传相似性系数最大，都为0.92，说明这2个优系亲缘关系很近，有可能源自同一株树。其次是从东冲畈村海拔98 m、平头岭村海拔473 m处采集的3、7号优系样品，相似性系数都为0.90，表明它们之间的亲缘关系很接近，遗传差异较小。而从平头岭村海拔588 m处采集的9号优系样品与从罗田县三里畈镇夏家铺村海拔296 m处采集的13号优系样品具有最小的遗传相似性系数，仅为0.39，可见它们之间的遗传差异比较大，亲缘关系较远。

2.4  聚类分析

在获得两两不同优系间的Dice遗传相似系数基础上，以185个位点的谱带为原矩阵，采用UPGMA法构建了罗田甜柿优系间的遗传关系系统聚类分析树状图，具体见图3。分析表明，聚类树状图与优系间的遗传相似系数反映出的情况基本一致，即遗传相似系数越高，亲缘关系越近，优系间的差异就越小。从树状图可以看出，40份优系材料间的遗传相似系数范围为0.39～0.92，表现出丰富的遗传多样性。

当遗传相似系数为0.60时，可将40个优系分为A组和B组2个组。在A组中，麻城市的优系全都聚在该组，罗田县大部分乡镇的优系聚在了一起;在B组中，罗田县部分乡镇的少数优系单独聚在了一起，说明不同地域之间的优系存在遗传差异，处在同一乡镇的优系之间也存在遗传差异，从而表现出了该地区野生罗田甜柿的遗传多样性;当在遗传相似系数为0.67处做割线L1时，可以将来自于不同地域的40份资源优系分成4个亚组。其中A组有3个亚组A1、A2、A3，B组仍然单独聚类成1个亚组。

当遗传相似系数为0.73时，来自于罗田县三里畈镇朱元洞村不同海拔的2个优系聚在了一起，独自成A3亚组，说明2个优系之间遗传相似性较高，同时也说明其与来自于其他地域的类群有较远的亲缘关系;在A1亚组中，来自于罗田县平湖乡东冲畈村海拔148 m的1号优系与来自于罗田县大崎乡平头岭村海拔588 m的9号优系在遗传相似系数为0.92时，聚在了一起，然后又在遗传相似系数为0.86时与来自于罗田县河铺镇丁家山村的海拔613 m的26号优系聚在了一起，其中1号和9号形成一支，很有可能是同一个母源。当遗传相似系数为0.90时，来自于罗田县平湖乡东冲畈村海拔98 m的3号优系与来自罗田县大崎乡平头岭村海拔473 m的7号优系聚在了一起;当遗传相似系数在0.68及以上时，A2亚组又可以分为2个小组，分别表述为A21小组和A22小组。在A22小组中，当遗传相似系数为0.78时，来自于罗田县河铺镇唐家山村海拔397 m的22号优系与来自于同镇的丁家山村海拔564 m的24号优系聚在了一起;来自于罗田县三里畈镇錾字石村的2个优系29号和30号也在0.79处相聚，后又在0.75处与同样来自于錾字石村的另外一个优系28号相聚在一起。从这个结果可以看出，野生罗田甜柿不同种源之间的差异随着地理距离的远近而大小不一。

另外，B组分别为来自于罗田县三里畈镇錾字石村不同海拔的10号、11号、12号3个优系，来自于罗田县三里畈镇夏家铺村不同海拔的13号、14号2个优系，来自于罗田县平湖乡毛家洞村的17号、上冲村的18号、大垴村的27号3个优系，等等。值得注意的是同一地域的17号和18号在遗传相似系数为0.84时相聚，而同一地域的27号与它们的遗传距离相对较远，遗传相似系数为0.67。

从聚类图的分析中可以看出，在相同的遗传相似系数处，来自于不同地域的罗田甜柿优系可以聚在一起，说明不同的地域也会有亲缘关系比较近的优系;同样来自于同一地域的优系也会具有不同的遗传相似系数，说明同一地域的优系彼此之间是存在差异的;正是这种交叉的亲缘性和差异性才构成了罗田甜柿的遗传多样性。

3  讨论

对于要求检测大量样品的遗传多样性研究来说，检测手段的稳定性至关重要。影响ISSR-PCR反应体系的因素有模版DNA浓度、引物浓度、dNTP、Taq-DNA聚合酶、循环数、退火温度等方面[9]。徐象华等在柿属（Diospyros L.）亲缘关系研究中完成了RFLP（Restriction fragment length polymorphism）、RAPD、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、SSR（Simple sequence repeats）、ISSR、IRAP（Inter retrotransposon amplified polymorphism）、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）等多种分子标记技术体系的构建，侧重于研究国外与国内及国内不同地区间种间的亲缘关系[10]。本研究采用ISSR标记通过对罗田甜柿不同地理位置的优系母树DNA序列的同源程度分析，试图确定罗田甜柿种质资源分布及地理位置的遗传差异，以期为进一步的种质资源保存和优系的品种审定提供佐证。

遗传标记是作物遗传育种研究的重要工具之一，ISSR以其设备技术简单、重复性高、多态性丰富的特点将在果树起源进化及系统分类研究方面发挥重大作用[11]。近年来，公共数据库的EST数量迅速增加，为ISSR标记的开发提供了一条快速而有效的途径。不过试验中由21对引物最终仅筛选出了9对多态性高的引物，说明筛选的效率较低，其原因可能来自两方面：一是EST数据较少，来源单一，所设计的引物本身就存在较高的冗余度;二是中国的柿属植物种间亲缘关系较近，不易得到有多态性的引物[12]。

果树在自然界中存在许多天然杂种，不少古老的品种是突变或者自然杂交得到的，其亲本来源不明。本次研究的供试材料为湖北省罗田县、麻城市具有优良性状的古老的罗田甜柿母树。我们应用NTSYS2.10e软件对扩增结果进行UPGMA法聚类分析，结果40个罗田甜柿优系大致被分为两大类，遗传相似系数从0.39到0.92。说明罗田甜柿资源分布具有明显的自然地理分区，分区内又具有遗传多样性。例如从麻城市采到的优系全都聚集在A区，而同一采集地的优系样品又有差异，如采自罗田县河铺镇丁家山村的26号优系就与同样采摘于丁家山的其他2个优系（24号、25号）相距较远，说明相同采集地的优系也有亲缘关系较远的情况存在，这可能与早期甜柿的人工移栽种植有关[10]。

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