辽细辛精油不同馏分杀虫活性比较

王桂清+李凡海+姬兰柱

摘要：采用超临界CO2萃取辽细辛精油，硅胶柱层析法分离精油，气相色谱-质谱法分析其成分。以小菜蛾和淡色库蚊3龄幼虫为试虫，对辽细辛精油及各馏分的杀虫活性进行了比较。结果表明，各馏分的杀虫效果不同，馏分A5成分比较简单，但其杀虫活性并不高;其他馏分（如A1和A6）的组成成分较多，然而它们的杀虫活性却较高，说明辽细辛精油中起杀虫作用的主要成分并非一种，可能多种成分均起作用。该结果为进一步研究和开发以辽细辛为原料的新型植物源杀虫剂奠定理论基础。

关键词：细辛精油;GC-MS;硅胶柱层析;杀虫活性

中图分类号：S482.3        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0355-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.025

Comparison of the Biological Activities of Asarum Volatile Oil and

Its Different Distillates

WANG Gui-qing1，LI Fan-hai1，JI Lan-zhu2

（1.College of Agronomy， Liaocheng University， Liaocheng 252059， Shandong， China; 2.Institute of Applied Ecology，

Chinese Academy of Sciences， Shenyang 110016， China）

Abstract： The asarum volatile oil was extracted with CO2 by supercutical fluid extraction（SFE） method and separated by silica column chromatography. GC-MS fingerprint chromatograms of different distillates were analyzed. The biological activities of the asarum volatile oil and different distillates were tested and compared by using the third instar larvae of Plutella xylostella and Culex pipiens pallens as the test insects. Results showed that the biological activities of different distillates were significant. The fifth distillate （A5） was unadulterated， but its biological activity was very low. Other distillates （for instance A1 and A6） were a mixture， but their biological activities were higher than that of A5. It is indicated that the main constituent of insecticidal action in asarum volatile oil was not onsdefold chemical compound. It is possible that many components in asarum volatile oil act on insecticide. It will provide a basis for developing new botanic insecticide using asarum as raw material.

Key words： asarum volatile oil; GC-MS; silica column chromatography; biological activity

辽细辛（Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum（Maxim）Kitag.）为马兜铃科多年生草本植物，又名北细辛、万病草、细参、烟袋锅花、东北细辛，属于重要的中草药，主产于中国东北，一直供应全国及出口，在国际市场上享有盛名[1]。细辛的药用部位为根及根茎，其主要的有效成分为挥发油即细辛精油[2，3]，近年来，它在农业生产上的价值也逐步显现。很多研究表明，细辛精油对昆虫可表现出不同程度的引诱、拒食、驱避、抑制生长发育及直接毒杀作用，具有良好的杀虫抑菌活性[4，5]。但研究限于未分离的细辛精油或主要单一成分如细辛醚等，而对于辽细辛精油不同馏分的杀虫活性鲜见报道。本研究采用超临界CO2萃取法提取了辽细辛精油，采用硅胶柱层析进行分离，同时使用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行指纹图谱分析，以小菜蛾3龄幼虫和淡色库蚊3龄幼虫作为供试昆虫，比较了各馏分的杀虫活性，为研究和开发新型植物源杀虫剂提供依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试植物样品辽细辛的根购买于同仁堂药房，将其进一步阴干，粉碎，过380 μm孔径筛。供试昆虫包括粘小菜蛾（Plutella xylostella）3龄幼虫和淡色库蚊（Culex pipiens pallens）3龄幼虫，均由沈阳化工研究院新药生测实验室提供。endprint

1.2  试验方法

1.2.1  气相色谱条件  石英毛细管柱HP-5MS，50 m×0.25 mm×0.25 μm;程序升温：首先以8 ℃/min升至120 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃/min升至280 ℃;载气：He;柱流量：0.9 mL/min;进样量：1 μL;进样口温度：250 ℃;接口温度：230 ℃;柱压：80 kPa;分流比：10∶1。

1.2.2  质谱条件  离子源为EI;电离能：70 eV;离子源温度：230 ℃;质谱扫描范围：50～500 amu;扫描周期：1 s。

1.2.3  精油提取方法  准确称取样品1.85 kg，装入5 L的萃取罐内，采用超临界CO2进行萃取，萃取条件：压力20 MPa，温度40 ℃，流量20 kg/h;解析釜I压力6～7 MPa，温度45 ℃;解析釜II压力5～6 MPa，温度35 ℃，萃取时间为60 min，每20 min收集提取物称量，密封，置4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4  辽细辛精油的图谱分析  将所得到的辽细辛精油用乙酸乙酯溶解后进行GC-MS分析鉴定。

1.2.5  硅胶柱层析分离  采用硅胶柱层析法对超临界CO2萃取法得到的细辛精油进行了分离。柱长50 cm，直径5 cm。硅胶为青岛海洋化工厂分厂生产，型号为粗孔ZCX-Ⅱ，粒度109～152 μm。装好柱后，将10 mL精油从最上端倒入，等精油被硅胶吸附后，用石油醚与乙酸乙酯的混合液进行洗脱，石油醚与乙酸乙酯的比例依次为8∶1、6∶1、4∶1、2∶1和1∶1。用20 mL指形管接洗脱液，指形管事先编号，同时跟踪试样洗脱情况，即每接1管洗脱液，用毛细管吸取少量点滴在层析板上，在紫外灯下观察显色情况。最后将显色的洗脱液全部点滴在层析板上进行层析，根据层析情况，合并洗脱液。

1.2.6  杀虫活性测定方法  采用叶碟法测定辽细辛精油对小菜蛾幼虫的活性。挑选长势良好、无药的甘蓝嫩叶，用湿布擦干净，再将甘蓝嫩叶用打孔器打成直径2 cm的叶碟，放到直径6 cm铺有滤纸的培养皿中，1皿1个叶碟，编号。用喷雾器将细辛精油药液（浓度分别为4 000、3 000、2 000、1 000和500 mg/L）喷在叶碟上，正反面喷均匀，用药量约0.5 mL，自然晾干。然后接入供试小菜蛾幼虫10头，3 次重复，于24 h调查试虫的死亡率，计算LC50。以喷含吐温-80的蒸馏水为对照。采用浸渍法测定辽细辛精油对淡色库蚊幼虫的杀伤作用。先将24孔培养板编号，分别在孔中加入带有蚊幼虫20条左右的水1.20、1.60、1.80、1.90和1.95 mL，再加入200 mg/L的母液0.80、0.40、0.20、0.10和0.05 mL，终体积为2 mL，终浓度为80、40、20、10和5 mg/L。在温度（25±1） ℃，相对湿度60%～80%，光照（L∶D=16 h∶8 h）的条件下培养24 h检查结果，计算LC50。振动培养板，并用镊子轻触蚊幼虫身体，以沉入孔底部不动者为死亡。每个样品重复3次，每次均以2%乙醇浸渍蚊幼虫作为空白对照。

2  结果与分析

2.1  辽细辛精油的指纹图谱分析

辽细辛根采用超临界CO2提取后，1.85 kg的原料共萃取得到42 g精油，萃取率为2.27%。精油萃取效率较高，品质较好，颜色为棕黄色。该精油指纹图谱如图1。由图可见，超临界CO2萃取得到的辽细辛精油的组成成分较多，能够确定峰值的就超过35种，如果把次要的小峰也算入的话，辽细辛精油的组成成分将超过40种。

2.2  辽细辛精油的分离

超临界CO2萃取法得到的精油（标记为A0）经过硅胶柱层析后，初次得到6个馏分，即A1-A6。这6个馏分的质谱图如图2-7。从指纹图谱看，这6个馏分仍然是混合物，其中馏分A5成分较少。

2.3  不同馏分杀虫活性比较

辽细辛超临界CO2萃取的精油（A0）及各馏分杀虫活性的结果如表1。从表中可以看出，各馏分的杀虫效果不同，其中馏分A6的杀虫活性最好，对小菜蛾和淡色库蚊的LC50分别为892.8 mg/L和1.27 mg/L，与萃取精油（A0，对2种试虫的LC50分别为1 408.0 mg/L和25.05 mg/L）相比，其杀虫活性分别提高36.59%和94.93%;对小菜蛾的杀虫活性比A0高的馏分还有A1、A2和A3，LC50分别为1 218.2 mg/L、1 274.7 mg/L和1 352.0 mg/L，杀虫活性分别提高13.48%、9.47%和3.98%;对淡色库蚊的杀虫活性比A0高的馏分还有A1和A4，LC50分别为6.31 mg/L和7.94 mg/L，杀虫活性分别提高74.81%和68.30%;杀虫活性最低的是馏分A5，对小菜蛾和淡色库蚊的LC50分别为5 705.8 mg/L和114.87 mg/L，与萃取精油（A0）相比，其杀虫活性显著降低;对小菜蛾的杀虫活性比A0低的馏分还有A4，LC50为1 504.1 mg/L，杀虫活性降低6.40%;对淡色库蚊的杀虫活性比A0低的馏分还有A2和A3，LC50分别为48.74 mg/L和62.36 mg/L，杀虫活性显著降低。

从表1还可以看出，同一馏分对不同试虫的杀虫效果不同，如A2和A3，与A0比较，对小菜蛾的杀虫活性均提高，提高率分别为9.47%和3.98%，而对淡色库蚊的杀虫活性均降低，说明同种物质对不同试虫的杀虫效果不同。

结合图2-7及表1可以看出，馏分A5成分比较简单，但其杀虫活性并不强，而其他馏分（如A1和A6）虽然组成成分较多，且组成成分存在差异，但其杀虫活性却较高，说明辽细辛精油中起杀虫作用的主要成分并非是单一的化合物，但具体情况，有待于今后的继续探索。endprint

3  小结与讨论

采用超临界CO2法萃取了辽细辛精油，并进行了GC-MS指纹图谱分析，结果表明辽细辛精油是由多种成分组成的混合物，成分较多，能够标定峰值的有35种。采用硅胶柱层析法对辽细辛精油进行了分离，初步得到6个馏分，其指纹图谱表明，各馏分均为混合物，馏分A5成分较少。以小菜蛾和淡色库蚊为试虫，对辽细辛精油及各馏分的杀虫活性进行了比较，表明各馏分的杀虫效果不同，与萃取精油比较，杀虫效果或提高或降低，馏分A5成分比较少，但其杀虫活性并不强，而其它馏分（如A1和A6）虽然组成成分较多，且组成成分存在差异，但其杀虫活性却较高，说明辽细辛精油中起杀虫作用的主要成分并非是单一的一种化合物，可能多种成分均起作用，但具体情况有待于继续探索。

细辛属于重要的中草药，在医药上应用广泛的，其精油（挥发油）在动植物虫害上也有一定的应用。杨银书等[6]研究了8种植物（川芎、细辛、前胡、橘皮、藿香、当归、石菖蒲、薄荷）精油对媒介硬蜱的驱避效果，结果表明细辛精油对草原革蜱（Dermacentor nuttallii）、日本血蜱（Haemaphysalis japonica）、青海血蜱（Haemaphysalis qinghainesis）、血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineous）若虫和成虫具有较好的麻痹及驱避作用。莫建初等[7]以黄胸散白蚁（Reticulitermes flaviceps）为对象，在室内对细辛的抗白蚁效果作了研究，结果表明华细辛（Asarum sieboldii Miq.）粉对黄胸散白蚁不仅有较强的毒杀效果，而且有驱避活性;刘树民等[8]研究显示，北细辛挥发油对栖北散白蚁具有较好的驱避作用和熏蒸活性;尹红等[9]发现北细辛醇提物与挥发油对栖北散白蚁也有较好的触杀效果。韩俊艳等[10]研究表明，北细辛挥发油在8 μg/mL 时对二斑叶螨的熏蒸毒性最强，24、48 h的螨死亡率分别为72.6%和100%。细辛精油及单一成分对蚊虫的生物活性，学者们研究的较多，王桂清等[11]研究证明辽细辛精油对淡色库蚊幼虫有较强的毒杀作用，对其成虫有较好的熏蒸作用;Perumalsamy等[12，13]发现细辛对淡色库蚊的成蚊与蚴蚊具有杀灭作用，其提取物有望开发成杀虫剂;张静等[14，15]的研究证明，细辛醚对家蝇、淡色库蚊和部分农业害虫有明显的杀虫效果，细辛醚对昆虫的致毒症状与神经毒剂类似;本研究也证明，辽细辛精油及馏分均具有一定的杀虫活性，作为植物源杀虫剂有一定的研究前景。

参考文献：

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