高血压颈动脉斑块阳性患者miR—375表达检测

李鸿翔　李近都　梁烨　李天资　蓝家富　李清锋

【摘要】目的探讨miR-375在高血压颈动脉斑块阳性患者的表达变化情况及其临床意义。方法检测23例高血压颈动脉斑块阳性患者（实验组）的血压和血清miR-375表达水平，并与12例健康者（对照组）比较。结果实验组的收缩压、舒张压、颈动脉内中膜厚度（IMT）和miR-375表达平均水平分别为（170.4±6.0）mmHg、（106.3±8.7）mmHg、（1.28±0.08）mm和（3.53±0.77），对照组分别为（132.2±3.8）mmHg、（86.4±6.6）mmHg、（0.83±0.17）mm和（2.36±0.76），实验组的收缩压和舒张压平均水平明显高于对照组（P<001），miR-375表达的平均水平也明显高于对照组（P<0.01）。结论miR-375或许作为致病因素，而不是保护因素参与高血压颈动脉斑块阳性疾病的发生和发展，miR-375过高表达对高血压颈动脉斑块阳性患者疾病可能有促进作用。

【关键词】原发性高血压；颈动脉斑块阳性；miR-375；基因调控

中图分类号：R544.1 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2015.01.004

高血压颈动脉斑块阳性是慢性血管疾病的重要危险因素之一，其与慢性血管事件关系密切，研究表明，高血压及其动脉粥样硬化的发病率和患病率呈快速增长趋势，严重威胁居民的生命健康，备受关注[1]。miR-375是一类特异性高表达于胰腺组织的非编码小RNA，通过转录因子（NF-κB）和肌侵蛋白（myotrophin，MTPN）调控血管细胞的病理和生理，维持动脉的正常机能，miRNA表达水平对其与靶基因结合的效率及其转录的活性有影响，并与动脉粥样硬化的发生和发展相关联[2～7]。为探讨高血压颈动脉斑块阳性患者与miR-375表达水平的关联性，本项研究检测了23例高血压患者（实验组）的颈动脉内中膜厚度（IMT）和血清miR-375表达水平，并与12例健康者（对照组）比较，结果报道如下。1对象与方法1.1研究对象选取2014年1～5月在我院体检部接受体检者，符合下列条件：①连续2天检测符合下列条件为患者：收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg即可诊断为高血压[8]；②颈动脉超声测量颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）内IMT，其中IMT≥1.2 mm，≤1.4 mm者为斑块阳性。③排除血栓出血性疾病、糖尿病、免疫性疾病、严重感染、肿瘤、慢性中毒、继发性高血压。并经阅读《临床实验观察须知》，充分了解治疗方法及其观察措施，理解可能存在的风险，愿意配合治疗和观察，签署《同意书》者入选为实验组，共23例，男13例，女10例，年龄50～60（54.5±3.0）岁。对照组12例，男7例，女5例，年龄51～59（54.3±3.0）岁，收缩压<140 mmHg并舒张压<90 mmHg，颈动脉超声测量CCA、ECA、ICA内IMT，IMT<1.0 mm。

1.2 方法①血压测量：使用经过验证的电子血压计，气囊长22～26 cm、宽12 cm的标准规格袖带。受试者应至少坐位安静休息5分钟，30分钟内禁止吸烟或饮咖啡，排空膀胱，取坐靠背椅，裸露上臂，上臂置于心脏水平，以Korotkoff第I音和消失音确定收缩压和舒张压水平。至少间隔5分钟再测量1次，取2次读数的平均值记录。如果2次血压值读数相差≥5 mmHg，应再次测量，取3次读数的平均值记录。②颈动脉超声检查用仪器ALOKA-α10型超声显像系统，探头频率为7.5 MHz。受检者取仰卧位，头略向后伸，转向被查的对侧，充分暴露颈部。先从锁骨内侧端横向检查颈总动脉，然后沿胸锁乳突肌外缘纵切扫查，依次显示CCA、ICA、ECA和椎动脉（VA）。

1.3 标本的采集与处置研究对象空腹10 h以上于早晨7：00～8：00采集静脉血，用静脉真空采血管（BD 762165 PAX gene Blood RNA Tube，由上海华雅思创生物科技有限公司提供）采全血4 ml，血样采集后，立即将采血管上下颠倒10次混匀，并于18℃～25℃正立放置至少2 h。先于-20℃放置24 h，然后转移至-80℃保存，于1 M内用RN23 RNA liquid超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒提取RNA。

1.4实时荧光定量PCR检测 miR-375的表达转染48 h后，用Trizol试剂法提取总RNA。A260/A280为1.8～2.0之间方可用于检测。取500 ng总RNA做逆转录反应。试剂盒提供RT及qPCR通用引物，操作步骤按试剂盒说明书进行。反应总体积为10 μL，包含cDNA模板1 μL（1∶10稀释）、qPCR通用引物1 μL，反应条件：95℃变性3 min，95℃作用5 s，62℃作用35 s，共40个循环，以U6为内参照，结果分析采用2-△△Q方法，以此值表示miR-375的表达水平。反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的Ct值。miRNA的表达水平采用相对定量方法，以2-ΔΔCt表示每个miRNA的变化倍数，再将结果转化为对数形式，ΔCt=CtmiRNA-CtU6（以此表示相对表达量），ΔΔCt=ΔCt（高血压组）-ΔCt（对照组）。

1.5 仪器和试剂盒 仪器：德国Biometra Tpersonal PCR，由上海恒久医疗器械有限公司提供；美国应用生物系统公司（Applied Biosystems

？倕 ）实时PCR扩增仪Step OnePlusTM，由爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司提供。试剂盒：miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒，均由上海江莱生物科技有限公司提供。所用化学试剂均为分析纯。

1.6 miRNA-375的表达检测 用qRT-PCR法：按miR-cute miRNA（吸附柱法）提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒说明书操作。引物序列由Prime premier 5.0软件自行设计，miR-375上游引物CCCTCTAGACCCCAAGGCTGATGCTGAGAAG，下游引物AAAGGTCCGCCGCCCGGCCCCGGGTCTTC。endprint

1.7统计学方法采用SPSS 17.0统计软件，计量资料组间比较用两独立样本均数t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果实验组的收缩压和舒张压平均水平明显高于对照组（P<0.01），miR-375表达的平均水平也明显高于对照组（P<0.01），miR-375与IMT相关性分析结果为：r=0.580，t=3.364，P=0.002，提示miR-375或许作为致病因素，而不是保护因素参与高血压颈动脉斑块阳性疾病的发生和发展。见表1。

表1两组血压、IMT与miR-375表达水平比较（±s）

组别n收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）IMT（mm）miR-375实验组23170.4±6.0106.3±8.71.28±0.083.53±0.77对照组12132.2±3.886.4±6.60.83±0.172.36±0.76t-19.8906.93410.7504.269P-0.0000.0000.0000.000

3讨论miR-375是近年发现的非编码小RNA，起初认为miR-375直接调控胰岛组织中特异性转录因子的表达，参与调控基因及信号转导通路，影响糖、脂代谢，对胰腺的形态、发育和功能有重要的作用。新近研究发现，miR-375的靶基因和靶蛋白比较多，调控网络比较复杂，目前认为miR-375在高血压的发生和发展过程中扮演着重要的角色。肌侵蛋白可与NF-κB相互作用，从而执行调节NF-κB活性的作用。而肌侵蛋白诱导的高血压血管细胞的生长又由活化的NF-κB途径介导。肌侵蛋白诱导的血管细胞的生长与NF-κB的结合和活化密切相关，提示肌侵蛋白激活NF-κB的核转运，并且活化了高血压基因的表达[9～11]。高血压颈动脉斑块阳性患者长时间血压升高引起的动脉增生性病变，导致动脉管壁增厚、僵硬而失去弹性和（或）管腔狭窄，由于其血液对血管壁的侧压力增加，损伤血管内膜，平滑肌细胞变性，血浆脂质渗入血管内膜细胞，形成血管粥样硬化，因此肌侵蛋白被认为是动脉粥样硬化起重要作用的效应因子[12]。NF-κB通过调节其靶基因的表达，在机体免疫应答、炎症及本病的发生发展过程中发挥着重要功能，NF-кB作为炎性反应相关转录因子，在动脉粥样硬化中对白细胞介素-8和血管内皮生长因子的异常表达具有重要的启动作用[13～16]。

本研究结果显示，高血压颈动脉斑块阳性患者miR-375表达的平均水平明显高于对照组（P<001），miR-375与IMT密切相关，提示miR-375或许作为致病因素，而不是保护因素参与高血压颈动脉斑块阳性疾病的发生和发展，其过高表达对高血压颈动脉斑块阳性疾病可能有促进作用，本课题组认为，进一步挖掘miR-375及其在高血压颈动脉斑块阳性疾病中的调控机制，寻找miR-375的调控基因以及靶基因，以miR-375为靶点设计小分子物质拮抗miR-375的作用，或许可以作为治疗高血压病的药用靶向，对提高本病的防治效果，保障患者的生命质量等有重要意义。参考文献[1] Lahmy R，Soleimani M，Sanati MH，et al.MiRNA-375 promotes beta pancreatic differentiation in human induced pluripotent stem （hiPS） cells[J].Mol Biol Rep，2014，41（4）：2055-2066.

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（收稿日期：2014-12-05 修回日期：2015-01-27）

（编辑：潘明志）endprint