早期胃癌侵袭转移相关分子标志物的研究进展

林 洁 毛建山

早期胃癌（EGC）是指肿瘤局限于黏膜或黏膜下层，无论是否存在淋巴结转移。EGC的诊断率在日本可达70%左右，内镜黏膜下剥离术（ESD）、内镜下黏膜切除术（EMR）等内镜切除技术目前已成为无淋巴结转移的EGC治疗的重要方法。内镜治疗具有微创，术后恢复快，能保持消化道的完整性等优点，日本EGC患者中约50%接受内镜治疗，然而内镜切除术只是局部的切除手术，不适用于已有淋巴结转移的EGC患者，因此判断或预测EGC的侵袭性、淋巴结转移情况成为EGC患者选择手术治疗或是内镜治疗的关键。EGC的内镜形态学特征以及超声内镜、CT、正电子发射型计算机断层显象（PET－CT）等影像学检查为判断胃癌侵袭性和淋巴结转移情况提供了重要依据，但形态学检查有一定局限性，因此寻找反映EGC侵袭转移能力和预后差异的分子标志物具有重要的临床意义。肿瘤的侵袭转移能力涉及许多分子信号通路的异常改变［1］，本文就EGC侵袭转移相关分子标志物的研究进展作一综述。

1 细胞黏附相关分子

E－钙黏蛋白（E－cadherin）是一种重要的黏附分子，参与细胞与细胞间的黏附，其表达下调将导致肿瘤细胞相互分离，获得侵袭转移能力［2］。其编码基因CDH1的杂合失活性种系突变可导致遗传性弥漫型胃癌的发生［3］，可见E－cadherin在胃癌发生发展中的重要作用。E－cadherin与另一介导细胞黏附的分子β－连环蛋白（β－catenin）形成复合体参与细胞间的黏附连接，两者在正常上皮细胞上均为膜性表达。当它们从膜性表达转变为胞质内表达时，则预示着细胞的游离性及转移潜力增强。Yoshii等［4］采用免疫组化研究28例EGC患者的E－cadherin和β－catenin表达与淋巴结转移的关系，结果显示两者双重膜性丢失与淋巴结转移相关，并与肠型EGC的关系更为密切。Yi Kim等［5］进一步研究E－cadherin膜表达下调的机制，结果提示CDH1的启动子甲基化导致了E－cadherin膜表达的下调。Lee等［6］对浸润至黏膜下层的EGC患者其黏膜下层与黏膜层E－cadherin表达的差异进行研究，结果显示黏膜下层E－cadherin的异常表达率（即膜性表达缺失或胞质、胞核内表达）高于黏膜层，黏膜下层异常表达与淋巴结转移显著相关。

调节E－cadherin表达的相关分子中，抗黏附素（dysadherin）是一种细胞膜糖蛋白，通过转录后调节使E－cadherin表达下调，可能与肿瘤转移相关［7］。Maehata等［8］采用免疫组化检测318例黏膜下浸润的分化型EGC的dysadherin和E－cadherin表达，结果显示dysadherin阳性表达（≥50%）合并E－cadherin阴性表达（≥50%）者相比其余形式的组合显示出更强的侵袭性，与中分化型、更深的黏膜下浸润、淋巴管浸润及淋巴结转移显著相关，而且dysadherin在淋巴结转移灶中的表达率相比原发灶更高，提示dysadherin可能参与了淋巴结转移过程。

肝肠钙黏蛋白（CDH17）属钙黏蛋白家族，在人体中仅在肝细胞及肠道细胞的基底面表达，与维持细胞极性和细胞间黏附有关。Lee等［9］采用免疫组化检测了193例TNM分期Ⅰ期胃癌的CDH17表达，结果显示CDH17表达阴性者的术后5年生存率显著低于表达阳性者（P＝0.006），并在另一项有关168例TNM分期Ⅰ期胃癌样本的研究中得到进一步验证（P＝0.007）。

2 紧密连接蛋白

紧密连接蛋白（claudin）是构成紧密连接的主要成分。claudin的表达在正常胃黏膜、肠化生上皮及胃腺癌中存在差异，claudin－3和claudin－4主要表达于肠化生上皮，而claudin－18主要表达于正常胃黏膜［10］。Matsuda等［10］研究显示，胃癌浸润前端claudin－3、claudin－4及claudin－18三者表达均降低的患者预后明显差于表达阳性者，并且组织学上的恶性程度更高。有研究亦报道claudin－4表达降低与未分化型胃癌、淋巴结转移及腹腔转移相关，生存率明显低于阳性表达者［11］。Okugawa等［12］采用免疫荧光染色检测18例黏膜下浸润型EGC患者的claudin表达情况，结果显示黏膜下浸润区claudin－3、claudin－7表达显著低于黏膜内的表达，claudin－3表 达 与 Ki－67 标 记 指 数 呈 负 相 关。Oshima等［13］采用免疫荧光检测75例分化型EGC的claudin－18表达，结果显示其表达低于周围正常黏膜及肠化生上皮，其中31例黏膜下浸润型EGC患者的黏膜下浸润前端claudin－18表达下调，与Ki－67标记指数呈负相关，研究进一步采用MKN74胃癌细胞系进行体外实验，结果发现claudin－18 siRNA作用后，细胞系claudin－18表达下调，其增殖和侵袭能力均明显增强，提示claudin－18表达下调可能与EGC增殖、侵袭能力增强相关。

3 基因组拷贝数变异

基因组拷贝数变异（CNA），即基因序列的获得、缺失或扩增，可引起原癌基因的扩增及抑癌基因的缺失，与肿瘤发展相关。Kuroda等［14］采用比较基因组杂交技术（CGH）进行配对比较23例黏膜下浸润型EGC患者黏膜内和黏膜下层的CNA，结果显示两者的数量差异无统计学意义，而同一病例CNA表现出相似性和异质性，如染色体7p12扩增仅出现于黏膜内，而11q13获得仅出现于黏膜下层，提示11q13获得可能与黏膜下浸润有关。比较有和无淋巴结转移的黏膜下浸润型EGC患者的黏膜下层组织（12例比15例）的CNA，结果显示有淋巴结转移的EGC黏膜下层检测到11q13、11q14、11q22、14q32获得及17q21扩增的情况更多，提示肿瘤亚群的这些改变可能获得淋巴结转移能力。同时免疫组化发现原癌基因ERBB2的过表达与17q21的扩增相关，提示ERBB2可能与黏膜下浸润型早期胃癌的淋巴结转移相关。

Nakayama等［15］为研究与管状腺癌进展有关的遗传改变，采用微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）分析管状腺癌的CNA，结果显示13例黏膜内癌患者中9例为MYC缺失和TP53获得（MYC－／TP53＋），3例为 MYC获得和／或 TP53缺失（MYC＋和／或TP53－）；9例发生黏膜下侵犯的管状腺癌中，黏膜层的CNA有7例为 MYC－／TP53＋，而深部浸润区仅1例为 MYC－／TP53＋，6例为MYC＋和／或TP53－，可见黏膜内管状腺癌以MYC－／TP53＋为主，而进展期管状腺癌深部浸润区以MYC＋和／或TP53－为主，提示 MYC＋和／或TP53－可能与管状腺癌的进展有关。Nakayama等［15］将胃癌含 MYC－／TP53＋者定义为休眠型，含MYC＋和／或 TP53－者定义为侵袭型。Sonoda等［16］进一步对未分化型胃癌（UGC）进行aCGH分析，其中包括组织类型含“层状结构（LS，代表印戒细胞癌发展初始阶段）”的印戒细胞癌（LS＋UGC）20例及含少量腺管（TC）成分而不含LS的进展期低分化癌（LS－／TC＋UGC）9例，结果LS＋UGC中侵袭型占46%，LS－／TC＋UGC中侵袭型占77%，且两者均未见休眠型。提示两者的恶性程度均较高，而后者可能预后更差，进一步采用非监督式分层聚类分析，根据基因谱差异可将上述低分化癌分为两种类型，结果显示A型以LS＋UGC为主，B型以LS－／TC＋UGC为主，B型可见更高频的驱动基因获得（其中与侵袭转移相关的基因为ETS1和Ephrin受体基因），提示B型预后更差。可见MYC和TP53拷贝数变异可预测胃癌的侵袭性，而基于aCGH的聚类分析可区分胃癌预后更差的亚型，有望应用于EGC分子分型。

4 微卫星不稳定性

微卫星不稳定性（MSI）是肿瘤遗传不稳定性的一种表现形式，MSI最早发现于遗传性非家族息肉病性结直肠癌（HNPCC）中，约90%的HNPCC存在MSI，HNPCC是一种错配修复基因突变引起的常染色体显性遗传疾病，DNA错配修复功能的丧失导致MSI的发生。Miyoshi等［17］检测了78例黏膜内EGC的5个微卫星位点（D17S855、D18S58、D18S61、BAT25和BAT40），其中38例为单发型EGC（无复发），26例为继发同时性多发性胃癌（随访1年内复发），14例为继发异时性多发性胃癌（随访1年以上复发），结果显示继发同时性或异时性多发性胃癌者 MSI阳性率（13／40）显著高于单发型（4／38），MSI阳性的单发型胃癌患者在随访中再发胃癌的累积发生率显著高于MSI阴性者。此外，Hasuo等［18］对110例行ESD治疗的 EGC进行MSI分析和免疫组化检测错配修复蛋白hMLH1表达，结果显示高频 MSI（多位点的 MSI）且hMLH1表达缺失者（9例），在3年的观察期中，异时性胃癌的复发率为67%，显著高于其他类型EGC。提示MSI可以作为预测EGC内镜下治疗后异时性复发的指标。

5 肿瘤干细胞表面标志物

肿瘤干细胞（CSC）是具有自我更新及多向分化潜能的肿瘤细胞亚群［19］。Takaishi等［20］在胃癌细胞系无黏附培养中发现部分胃癌细胞系具有成球状集落现象，将其植入免疫缺陷小鼠，可生长成皮肤肿瘤，该结果提示胃癌干细胞的存在。此外，Takaishi 等［21］在研究MKN－45、MKN－74 和NCI－N87人胃癌细胞系时发现，CD44可能是胃癌干细胞的表面标志物。Chen等［22］对16项研究进行荟萃分析，结果提示标志物CD44阳性表达与胃癌淋巴结转移、远处转移、TNM分期Ⅲ／Ⅳ期等预后不良因素相关，并且比阴性表达者的预后更差，总生存率更低。CD133也是多种肿瘤的肿瘤干细胞表面标志物，Lee等［23］对100例进展期胃癌术后复发情况进行研究，发现CD133阳性表达者（n＝23）5年无病生存率为28%，而阴性表达者为65.8%，提示CD133与进展期胃癌术后复发相关。目前CSC表面标志物与EGC预后关系的报道不多，Hirata等［24］进行了一项前瞻性研究，对65例早期胃癌ESD标本进行免疫组化检测CD44v9表达，术后随访36个月，监测患者的复发情况，结果发现13例复发，其中10例CD44v9表达阳性，CD44v9阳性表达组的复发率（76.9%）显著高于阴性组（5.8%），风险比（HR）为21.8，其中有1例CD44v9高度表达者，术后复发2次。以上研究提示CD44v9有望成为预测ESD术后复发风险的分子标志物。

6 miRNA

miRNA是一类由18～25个核苷酸组成的非编码小RNA，通过与靶基因mRNA碱基配对降解mRNA或阻碍其翻译，起到靶基因沉默作用。miRNA在肿瘤中根据其作用靶基因的不同，可起促进肿瘤生长、转移或抑制作用［25－26］。研究表明，miRNA与胃癌的预后关系密切，可作为预后判断标志物，如胃癌 miR－10b、miR－21、miR－212高表达，或miR－125a、miR146a等低表达均提示胃癌转移风险提高，预后不良［25］。Shin等［27］研究了59例 EGC组织miRNA－135a的表达，结果显示发生淋巴结转移者miRNA－135a表达下调率（75%）显著高于无淋巴结转移者（27.5%），同时免疫组化检测肿瘤ROCK1表达，结果显示有淋巴结转移者ROCK1（miRNA－135a的靶基因之一）阳性表达率显著高于无淋巴结转移者。进一步用极少表达miRNA－135a的SNU668和表达MiRNA－135a的YCC2胃癌细胞系进行实验，发现SNU668细胞系加入miRNA－135a类似物后，细胞生存、上皮间质转化及侵袭转移能力均减弱，Western－blot显示ROCK1表达明显降低；YCC2细胞系加入miRNA－135a抑制剂后，细胞生存、上皮间质转化及侵袭转移能力均增强，Western－blot显示ROCK1表达明显提高；YCC2细胞系同时加入 miRNA－135a抑制剂和 ROCK1 siRNA后，ROCK1表达明显下降，细胞系侵袭转移能力均减弱。提示EGC中miRNA－135a通过下调ROCK1表达实现对淋巴结转移的抑制作用。

7 展望

随着EGC侵袭、转移相关分子标志物研究的不断进展，有望对EGC进行分子分型，并进一步明确各个亚型的临床意义，指导EGC患者选择最佳的治疗方案。

1 Ng L，Poon RT，Pang R.Biomarkers for predicting future metastasis of human gastrointestinal tumors.Cell Mol Life Sci，2013，70：3631－3656.

2 Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer：the next generation.Cell，2011，144：646－674.

3 Kluijt I，Sijmons RH，Hoogerbrugge N，et al.Familial gastric cancer：guidelines for diagnosis，treatment and periodic surveillance.Fam Cancer，2012，11：363－369.

4 Yoshii T，Miyagi Y，Nakamura Y，et al.Pilot research for the correlation between the expression pattern of E－cadherin－betacatenin complex and lymph node metastasis in early gastric cancer.Tumori，2013，99：234－238.

5 Yi Kim D，Kyoon Joo J，Kyu Park Y，et al.E－cadherin expression in early gastric carcinoma and correlation with lymph node metastasis.J Surg Oncol，2007，96：429－435.

6 Lee KB，Park do J，Choe G，et al.Protein expression status in mucosal and submucosal portions of early gastric cancers and their predictive value for lymph node metastasis.APMIS，2013，121：926－937.

7 Batistatou A， Charalabopoulos AK， Scopa CD，et al.Expression patterns of dysadherin and E－cadherin in lymph node metastases of colorectal carcinoma.Virchows Arch，2006，448：763－767.

8 Maehata Y，Hirahashi M，Aishima S，et al.Significance of dysadherin and E－cadherin expression in differentiated－type gastric carcinoma with submucosal invasion. Hum Pathol，2011，42：558－567.

9 Lee HJ，Nam KT，Park HS，et al.Gene expression profiling of metaplastic lineages identifies CDH17 as a prognostic marker in early stage gastric cancer.Gastroenterology，2010，139：213－225，e213.

10 Matsuda Y，Semba S，Ueda J，et al.Gastric and intestinal claudin expression at the invasive front of gastric carcinoma.Cancer Sci，2007，98：1014－1019.

11 Ohtani S，Terashima M，Satoh J，et al.Expression of tightjunction－associated proteins in human gastric cancer：downregulation of claudin－4 correlates with tumor aggressiveness and survival.Gastric Cancer，2009，12：43－51.

12 Okugawa T，Oshima T，Chen X，et al.Down－regulation of claudin－3is associated with proliferative potential in early gastric cancers.Dig Dis Sci，2012，57：1562－1567.

13 Oshima T，Shan J，Okugawa T，et al.Down－regulation of claudin－18 is associated with the proliferative and invasive potential of gastric cancer at the invasive front.PLoS One，2013，8：e74757.

14 Kuroda A，Tsukamoto Y，Nguyen LT，et al.Genomic profiling of submucosal－invasive gastric cancer by array－based comparative genomic hybridization.PLoS One，2011，6：e22313.

15 Nakayama T，Ling ZQ，Mukaisho K，et al.Lineage analysis of early and advanced tubular adenocarcinomas of the stomach：continuous or discontinuous？BMC Cancer，2010，10：311.

16 Sonoda A，Mukaisho K，Nakayama T，et al.Genetic lineages of undifferentiated－type gastric carcinomas analysed by unsupervised clustering of genomic DNA microarray data.BMC Med Genomics，2013，6：25.

17 Miyoshi E，Haruma K，Hiyama T，et al.Microsatellite instability is a genetic marker for the development of multiple gastric cancers.Int J Cancer，2001，95：350－353.

18 Hasuo T，Semba S，Li D，et al.Assessment of microsatellite instability status for the prediction of metachronous recurrence after initial endoscopic submucosal dissection for early gastric cancer.Br J Cancer，2007，96：89－94.

19 Takaishi S，Okumura T，Wang TC.Gastric cancer stem cells.J Clin Oncol，2008，26：2876－2882.

20 Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al.Isolation of gastric cancerinitiating cells using cell surface marker Cd44.Gastroenterology，2007，132：A632－A633.

21 Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.Stem Cells，2009，27：1006－1020.

22 Chen Y，Fu Z，Xu S，et al.The prognostic value of CD44 expression in gastric cancer： a meta－analysis. Biomed Pharmacother，2014，68：693－697.

23 Lee HH，Seo KJ，An CH，et al.CD133 expression is correlated with chemoresistance and early recurrence of gastric cancer.J Surg Oncol，2012，106：999－1004.

24 Hirata K，Suzuki H，Imaeda H，et al.CD44 variant 9 expression in primary early gastric cancer as a predictive marker for recurrence.Br J Cancer，2013，109：379－386.

25 Wu HH，Lin WC，Tsai KW.Advances in molecular biomarkers for gastric cancer：miRNAs as emerging novel cancer markers.Expert Rev Mol Med，2014，16：e1.

26 Shiotani A，Haruma K，Graham DY.Metachronous gastric cancer after successful eradication. World J Gastroenterol，2014，20：11552－11559.

27 Shin JY，Kim YI，Cho SJ，et al.MicroRNA135a suppresses lymph node metastasis through down－regulation of ROCK1 in early gastric cancer.PLoS One，2014，9：e85205.