伪狂犬病诊断方法研究进展及其应用情况

莫伟强，郭伟军

（1.长治市畜牧局，山西 长治　046000；2.山西隆克尔生物制药有限公司）

伪狂犬病诊断方法研究进展及其应用情况

莫伟强1，郭伟军2

（1.长治市畜牧局，山西 长治046000；2.山西隆克尔生物制药有限公司）

伪狂犬病（PR），又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒亚科、水疱病毒属的甲型疱疹病毒引起的危害多种家畜和野生动物的一种急性传染病。感染该病的新生仔猪死亡率可达100%。

伪狂犬病在1813年首次发生于美国的牛群中，1902年由匈牙利学者Aujeszk’s证明为病毒引起；1934年由Sabin和Wright确定为疱疹病毒。1947年刘永纯在我国分离到伪狂犬病病毒（PRV）。目前该病呈世界分布，我国也广为流行，是当前危害养猪业的最重要的传染病之一。目前，PRV血清型只有一种。但近年来，PRV不断发生变化，在流行过程中有毒力增强的现象。至今为止的所有疫苗都只能抑制临诊症状的出现，不能控制感染和排毒。动物一旦被感染，病毒可在动物体内呈长期潜伏感染状态，难以清除。有时，在受到体内或外界因素的刺激后，病毒还可被重新激活而排毒传播。因此，早期快速而准确地检测PRV致病毒株对有效控制PRV的流行具有重要意义。

1　病原学诊断

PRV病毒的分离鉴定被认为是检测病原的金标准，因该方法比较耗时，而且所需材料较高，一般作为新方法建立的验证方法。常采用细胞培养方法分离病毒。采用病猪的肾脏、脑、肝、脾及扁桃体等组织，匀浆后加适宜的双抗（青霉素、链霉素）制成乳剂，离心（3 000 rpm）10 min，取上清液接种培养成致密单层的细胞，观察直至出现特征性细胞病变（CPE），镜检观察细胞中有无核内包涵体。这种方法敏感性较差。

电镜技术可以直观、准确地鉴别病毒，根据病毒的形态、结构和大小等不同特征，可以作出诊断。电镜下，PRV病毒粒子为椭圆形或圆形，二十面体立体对称。位于细胞核内的无囊膜的病毒粒子直径约110～150 nm，位于胞浆内的带有囊膜的成熟病毒粒子直径约为150～180 nm，囊膜外有呈放射状排列的纤突。该方法直观、快速，但该方法比较复杂，一般仅限于以研究为目的的应用。

2　血清学诊断技术

2.1传统血清学试验

2.1.1琼脂免疫扩散试验（AGID）

自从Gutekunst D E（1997）首次报道了利用微量琼脂扩散试验检测猪血清中PRV抗体以来，由于AGID技术操作简单，结果准确，无需特殊设备，与血清中和试验（SNT）技术相比有很大的优势，因此广泛应用于基层兽研单位和大型猪场的现场定性诊断及猪群隐性无感染的普查。吴斌等（1997）将AGID和SNT进行了比较试验，发现与SNT的阳性符合率为94%，可以作为一种检测伪狂犬病和抗体水平的检测。研究表明，利用AGID技术对5个猪场进行了抗体检测，猪场的血清阳性率为80.0%，显示了AGID技术的简便和快捷。

2.1.2乳胶凝集试验技术（LAT）

乳胶凝集试验技术是利用抗原和抗体特异性结合的特点，将抗原先用乳胶包被，然后再与相应血清反应，如数分钟内发生凝集，可判定有PRV感染，数分钟内即可得出结果。我国研究人员应用血清中和试验（SNT）和伪狂犬病乳胶凝集试验（LAT）诊断试剂盒进行了PRV抗体效价测定和相关性分析，结果表明，两种方法检测结果符合率高，特异性强，LAT比SNT敏感、快速简便和实用。我国研究人员在克隆表达的基础上建立了gG-LAT和gE-LAT，结果表明，gG-LAT特异性强、敏感性高，可用于区分gG基因缺失疫苗活苗免疫猪与自然感染野毒的血清学阳性猪；gE-LAT特异、敏感且重复性好，能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。此法需时短、特异性较强、简便、实用，利于基层兽医单位和规模养猪场推广应用。LAT操作简单、方便、快速，且敏感性高、特异性强，适用于疫病监测或流行病学调查，以及种猪群检疫净化阳性猪初次筛选。

2.1.3反向间接血凝试验（RPHA）

我国研究人员应用单克隆抗体技术建立了RPHA检测PRV抗原，并与VI比较，发现RPHA不仅特异性强，且与VI有同等的阳性检出率。但RPHA试验设备要求低，操作简便，结果直观，更适合于基层使用。

2.1.4病毒中和试验（NT）

病毒中和试验（NT）作为病毒检测的经典方法，是世界上多数国家诊断PR的法定方法之一。通常应用已知病毒检查待检血清中的特异性抗体，该方法操作简便，可在PK15、鸡胚成纤维细胞中进行。判定标准有观察细胞病变、免疫荧光染色等多个标准，但结果往往带有主观因素。虽然NT有较高的灵敏度，是一种常用的诊断方法，但该法操作繁琐，工作量大，且受技术、细胞等条件限制，给临床应用带来一定的困难。

2.2酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA检测法已被广泛应用于PRV的检测，ELISA在PRV的早期感染、持续感染中均得到应用，并可以同时用于特性抗原和抗体的检测。在诊断方面，定期采血监测正常猪群中PRV抗体的ELISA效价，当猪群出现症状后，根据ELISA抗体升高的程度判断是否存在感染PRV。母源抗体的存在对疫苗的免疫效果产生影响，常应用ELISA检测方法对疫苗免疫后血清中抗体的情况进行调查。

2.2.1间接ELISA

Mout（1978）、A fshar（1987）、蒋玉雯（1988）等分别建立了检测伪狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA敏感性高，且快速、简便，适于大面积血清学调查。我国研究人员用gE鉴别ELISA试剂盒调查某猪场流行情况，母猪阳性率为81%，但缺点是此种方法费用昂贵，难以在基层推广。

2.2.2DOT-ELISA

该方法是一种以硝酸纤维素膜等固相化基质膜为载体的ELISA，用于检测抗体或抗原，具有简便、经济、结果判定直观等优点，但是也存在结果判断主观性强的不足。李克荣（1989）、李健强（1990）等分别应用混合纤维素酯微孔滤膜作固定支持物，用辣根过氧化物酶标记的SPA建立了斑点-ELISA（DOT-ELISA），该法检测PRV抗体具有特异性强、灵敏度高等优点，使ELISA方法可用肉眼观察结果，其敏感性明显高于SN，适合大面积血清学普查。该法不仅继承了常规ELISA的优点，而且还具有抗原用量少、节省材料、不需特殊仪器、结果便于长期保存、快速简便等优点。

2.2.3单克隆抗体夹心ELISA

单抗夹心ELISA是将单抗的特异性与ELISA方法相结合起来，使其特异性和敏感性大大提高。苗得园等（2001）建立了由单抗介导的检测PRV的单抗夹心LAB-ELISA方法，结果表明，该方法不与其他常见病原体产生交叉反应，病毒的最低检出含量为8.9μg/ml。检测时最佳采样部位是猪脑及扁桃体。对人工感染兔、自然感染猪以及临床可疑病猪的检出率分别为75%、75%及72.7%。该方法将特异性单抗和生物素-亲和素系统引入传统的ELISA中，是一种具有良好特异性及较高敏感度的诊断方法。

2.2.4双抗夹心ELISA

双抗体夹心ELISA是PR临床诊断和进出口检疫的一种简便而可靠的方法。祁小乐等（2004）利用所制备的兔抗PRV IgG和McAb建立的单克隆抗体双夹心法，最低病毒检出量为200 μg/ml，与动物实验、病毒分离和中和试验符合率较高。我国研究人员利用双抗体夹心ELISA法对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器进行检测，抗体包被量为每孔5μg，酶标抗体工作浓度为1：200，结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高，其次为心、肝、脾、肾等组织。与VI和电镜比较，三种方法PRV的检出率在统计学上无显著差异。

2.3免疫胶体金诊断技术

胶体金免疫层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来建立的一种快速免疫学检测技术。该技术最早用作电镜的示踪标记物，并逐步应用于传染病检测。我国研究人员研发的用于猪PRV gE抗体检测的免疫层析试纸条，无需任何设备20 min内可检测抗体效价，该试纸条具有快速、简便、灵敏、特异性好等特点，非常适用于基层实验室和养殖户。我国研究人员以纯化的抗人红细胞单链抗体（SeFv）-PRV gE蛋白双功能融合蛋白为诊断抗原和胶体金标记物，以羊抗猪IgG包被硝酸纤维膜作为质控带，制作检测PRV gE抗体的双抗原胶体金试纸条。试纸条在室温保存6个月，其特异性和敏感性没有明显变化；与美国IDEXX和法国LSI gE—ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果比较，1 164份猪血清的符合率均为90.55%。制备的胶体金试纸条具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点，可用于PRV野毒感染的快速筛查。

3　病毒RNA诊断技术

3.1核酸杂交技术

核酸杂交技术是一种分子水平的检测技术，是利用碱基互补原理检测目的核酸片段具有敏感性、特异性强等特点，其最重要的一环就是特异性探针标记，目前常用的标记物有同位素、生物素及地高辛等。国外研究人员首次使用核酸探针技术鉴定了野外分离的PRV，从而获得了流行病学的研究资料。国内也存在利用探针检测技术的研究，采用32P探针标记PRV全基因组和重组质粒应用斑点杂交技术，从而获取培养物中的PRV存在的信息，能检测出10 pg的PRV-DNA，并具有较高的特异性。

3.2PCR

PCR技术用于PRV诊断使诊断技术提高到基因水平。该技术是20世纪80年代建立起的一项体外酶促扩增DNA新技术，可用于PRV DNA的扩增。也适用于检测PRV潜伏感染猪，并且能快速鉴别PR疫苗毒与野毒。该方法具有简便快捷、灵敏度高和特异性强的特点。

3.3荧光PCR

近几年来，有不少报道运用荧光定量PCR用于传染病的诊断，表现出良好的特异性和敏感性，显示出较好的应用前景。实时荧光PCR与普通PCR相比，其特异性和灵敏度都要更高。我国研究人员以伪狂犬病毒（PRV）保守的gE基因序列为参考，建立了一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为每微升1.0×102～1.0×107拷贝，灵敏度达每微升DNA102拷贝，比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR，同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品，阳性检出率为63.6%（42/66）。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。

我国研究人员建立的检测猪伪狂犬病毒（PRV）多重实时荧光定量PCR方法，具有高度特异性，与其他病原无明显交叉反应；检测灵敏度高，可检出每微升1.0×101拷贝的阳性质粒或每毫升1TCID50的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测，其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致。

我国研究人员建立的区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达每微升2.23×10拷贝，比常规PCR检测方法高100倍；对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%，两者符合率为90%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可同时检测大量样品，可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。

3.4限制性核酸内切酶分析

用限制性核酸内切酶对病毒DNA进行酶切，可以呈现不同的带型，从而作出诊断。国外研究人员对Bartha、Norden等疫苗毒株及Ka等野毒株DNA用Bam HI、EgIll、Kpn I酶切分析，发现弱毒株在US区有缺失。Giekens等对NIA-3等野毒株和Rartha、BUK、Ercegovac、B-KAL、MK-25五个弱毒疫苗株DNA以BamHI酶切分析也证实疫苗株在US区有缺失，导致酶切图谱改变。此法可用于分子流行病学调查。

3.4环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）

RT-LAMP技术是建立在基础PCR基础上的一种新型的核酸检测的方法，具有简便、快速高效、敏感性强等优点。我国研究人员通过对伪狂犬病毒gE基因保守区域引物设计建立的RT-LAMP方法，最低检测量可达到100个拷贝质粒，敏感性比常规PCR方法高10倍。我国研究人员通过对PRV高度保守基因gB引物设计建立的RT-LAMP对PRV的检测敏感性是PCR方法的100倍，最低能够检测10个拷贝的目的基因。我国研究人员利用新的荧光染料罗丹明B衍生物作指示剂建立的可视化LAMP检测PRV的方法，在63℃下恒温反应40 min即可得到肉眼可视的结果，可视化LAMP结果与电泳结果一致。该方法可以快速、直观、准确地检测PRV，在诊断动物疾病上有广阔的应用前景，适合在基层养殖场应用。

4　小结

目前PR病原学诊断、血清学诊断、分子生物学检测方法的研究在广度和深度上已有了较大进展，但各种方法各有优缺点，每一种方法都难完全做到快速、简便、灵敏、特异、经济和实用。因此对PRV感染的诊断必须建立在临床初步诊断的基础上，结合实验室诊断手段，快速确定病原，然后根据判定结果，制定相对应的免疫程序，达到快速防治PRV感染的目的。建立和完善用于我国的PR控制和消灭该病的诊断方法，是我国广大兽医科研工作者面临的重大课题之一。□