格列苯脲有关物质检查中色谱柱的选择

孙 义，周学辉，王志英，曾玉香

（天津渤海职业技术学院，天津 300402）

高效液相色谱法（HPLC）具有选择性高、分离效率高、灵敏度高、分析速度快等特点，应用越来越广泛。目前，各国药品标准越来越多地使用高效液相色谱法作为含量测定和有关杂质检查的方法［1］。高效液相色谱法的核心是起分离作用的色谱柱，色谱柱的种类很多，其中以硅胶为基质的反相色谱柱尤其是C18柱应用最为广泛。齐宗韶［2］介绍了色谱法在《中华人民共和国药典（2005年版）》（简称《中国药典》）一部、二部中的应用，指出HPLC法主要选用C18柱（反相色谱柱）。对比中国、美国、英国、日本等国和欧盟药典中对HPLC方法的描述，发现给出的色谱柱信息通常比较简单。以格列苯脲的测定为例，《中国药典》对色谱柱只规定“用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂”，信息非常简单。药品标准起着监控药品质量的作用，HPLC法作为含量测定方法和有关杂质检查的方法，更应确保方法的准确性和重现性［3］。目前市场上有600多种C18色谱柱［4］，且不断有新的色谱柱出现。采用不同色谱柱分析具体样品时，由于色谱柱选择性的差异，溶质的保留值、色谱峰之间的分离度等都可能出现较大的差异［5－6］，导致药典执行过程中很难保证检查方法的重现性。以格列苯脲的测定为例，李莉等［7］在HPLC法测定保健食品及中药制剂中化学降糖药的含量时采用Zorbax SB－C18柱（250mm×4.16mm，5μm）测定，格列苯脲的保留时间为15.134min。黄作君等［8］在高效液相色谱法测定人血浆中格列苯脲浓度时采用Nova－pak C18柱（4.6mm×250mm，4μm）进行测定，格列苯脲保留时间为14.600min。刘淑花等［9］在高效液相色谱法测定消渴平胶囊中格列苯脲含量时采用Kromasil C18柱（200mm×4.6mm，5μm）测定，格列苯脲的保留时间为14.148min。朱俐等［10］在HPLC快速检测药品及其在降糖类药品中的应用时采用Inertsil ODS－SP（4.6mm×150 mm，5μm）色谱柱，格列苯脲保留时间为7.000 min。可见在测定条件近似的情况下，采用不同的色谱柱，所获得的结果是不同的，这对于实验室之间数据的比较和交换很不利。此外，在重复某一药物特定的HPLC方法时，有时无法获得方法中所用的色谱柱，这就需要寻求同类型的色谱柱，即选择性一致的色谱柱。在实际工作中也已经证明选择相同类型的色谱柱有利于不同实验室间的数据交换［11］。如何进行色谱柱的选择呢？本文以降糖药格列苯脲为例，参照欧洲药典（EP7.0）测试了几种不同的色谱柱，比较了不同分类方法对色谱柱选择的作用，对色谱柱的选择提供参考，为格列苯脲的有关物质检查提供依据，为格列苯脲的分析检测打好基础。

格列苯脲为磺酰脲类口服降血糖药物，有强大的降血糖作用，对大多数Ⅱ型糖尿病患者有效，可降低空腹及餐后血糖，糖化血红蛋白。使用格列苯脲虽易致低血糖，但由于其价格低廉，临床上仍在广泛应用。按照欧洲药典（EP7.0），格列苯脲有关物质的检查采用高效液相色谱法（HPLC）。EP7.0规定，色谱柱柱长为0.10m，柱径为4.6mm，BDS柱。色谱柱种类众多，从数目如此多的色谱柱中选出可行的色谱柱显然是比较困难的。如果有一定的方法可以选出分离效果相同的色谱柱，那么色谱柱的选择就会简单。王明娟等［12］和张伟清等［13］都提到了对色谱柱进行分类是解决色谱柱选择的方法。

一些学者经过大量实验，得到了158根不同型号色谱柱的参数，并依据色谱柱的发展简史将硅胶色谱柱分为3大类:A型色谱柱（即旧型色谱柱，old－type columns），B型色谱柱（即新型色谱柱，new－type columns）和E型色谱柱（即内嵌极性基团或极性基团封尾的色谱柱，embeddedpolar－group columns，EPG）［14－16］。DORA等［17－18］依据经验法的考察结果也将硅胶基质色谱柱分为3大类:Ⅰ类（主类，数目最多），Ⅱ类（硅羟基活性较高）和Ⅲ类，其中Ⅰ类分为Ⅰ－a类和Ⅰ－b类。Ⅰ－a类色谱柱多数属于B型色谱柱，Ⅰ－b类色谱柱包括部分A型色谱柱、孔径大于120Å的B型色谱柱及整体柱等。此类分析结果与JONATHAN等［14］依据色谱柱发展简史得到的分类结果接近。

本文选取Venusil ASB C18，Venusil MP C18，Venusil XBP C18，Venusil XBP－C18（L），Venusil XBP－C18（2）共5种色谱柱，对其进行分类并按照EP7.0方法进行系统适应性测试。所选取的Venusil ASB C18，Venusil MP C18，Venusil XBP C18，Venusil XBP－C18（L），Venusil XBP－C18（2）柱，按照JONATHAN等的分类方法属于B型柱［19］，按照DORA等对硅胶基质色谱柱的分类方法，Venusil MP C18，Venusil XBP－C18（2），Venusil XBP C18属于Ⅰ－a类柱；Venusil ASB C18，Venusil XBP－C18（L）属于Ⅰ－b类柱。JONATHAN等［14］和WILSON等［16］的研究结果表明，B型色谱柱差异较小，绝大多数B型色谱柱存在等同色谱柱。所选色谱柱都属于B型色谱柱，其分离性能应接近［18］。但是这种分类方法还不能说明哪一种色谱柱更接近EP7.0方法所需的色谱柱。EP7.0参考色谱柱为Hypersil C18BDS（4.6mm×100mm，3μm）。按照JONATHAN等［14］分类方法，Hypersil C18BDS属于A类柱；按照DORA等［18］对硅胶基质色谱柱的分类方法，Hypersil C18BDS属于Ⅰ－b类柱。按照DORA等［18］的分类方法，Venusil ASB C18，Venusil XBPC18（L）与EP7.0参考色谱柱Hypersil C18BDS属于同一类型色谱柱，故按照分类方法推断其测试结果应更接近。

1 主要试剂与仪器

主要试剂:格列苯脲片（规格为2.5mg），山西云鹏制药有限公司提供；格列齐特，山东某药厂提供。

主要仪器:Agilent 1260HPLC。

2 色谱条件

流动相:梯度洗脱。流动相A:缓冲液（101.8 g/L的三乙胺溶液，用磷酸调节pH值至3.0）－乙腈－水（体积比为20∶50∶930）；流动相B:流动相A－水－乙腈（体积比为20∶65∶915）；检测波长:230 nm；柱温:35℃；流速:0.8mL/min；进样量:10μL。检测结果见表1。

表1 检测结果Tab.1 Test result

3 样品配制

3.1 系统适用性试验溶液的配制

取格列齐特5mg，置于100mL容量瓶中，加供试品溶液2mL，用甲醇定容至刻度。取1mL该溶液，用甲醇稀释至10mL，即得。

3.2 供试品溶液的配制

取格列苯脲片10片，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声10min，过滤，即得。

4 供测试的色谱柱参数

ASB C18（4.6mm×150mm，3μm），MP C18（4.6mm×150mm，3μm），XBP C18（4.6mm×150 mm，3μm），XBP－C18（2）（4.6mm×150mm，3 μm），XBP－C18（L）（4.6mm×150mm，3μm）。

5 结果与讨论

5.1 结果

测试5种色谱柱的试验结果见表2。测试色谱图以ASB C18柱为例，见图1。

表2 5种色谱柱有关物质检查系统适用性试验结果Tab.2 System suitability test result of five columns on related substances

图1 格列苯脲有关物质检查系统适用性试验色谱图（ASB C18柱）Fig.1 Chromatogram of the test for system suitability on related substences of glibenclamide using ASB C18 column

5.2 讨论

欧洲药典系统适用性试验中要求格列苯脲与格列齐特峰之间的分离度大于5.0。通过表1的数据可以看出，5种色谱柱均能满足欧洲药典系统适用性试验的要求。欧洲药典提供的格列苯脲的保留时间为5min，其中ASB C18，XBP－C18（L）的保留时间与其接近（欧洲药典采用的是10cm长的色谱柱，供测试的是15cm的色谱柱），而其他色谱柱保留时间则相差较大。

按照JONATHAN等［14］分类方法，几款色谱柱均属于B型色谱柱，分析结果证明分离都达到要求，但是按照JONATHAN等分类方法没有能够说明哪一款色谱柱与EP参考色谱柱Hypersil C18BDS测试结果更接近。按照DORA等［18］对硅胶基质色谱柱的分类方法，Venusil ASB C18，Venusil XBP－C18（L）与EP参考色谱柱Hypersil C18BDS属于同一类型色谱柱，经过对格列苯脲进行系统适应性试验，验证了其结果确实最为接近，这2种色谱柱测定供试品溶液的色谱图分别见图2和图3。可以看出，这2种色谱柱与EP的要求非常接近，能够满足供试品的分离要求，以供后续的检查。

图2 格列苯脲有关物质检查供试品溶液色谱图（XBP－C18（L）柱）Fig.2 Chromatogram of the test solution in separating glibenclamide from related substences using XBPC18（L）column

图3 格列苯脲有关物质检查供试品溶液色谱图（ASB C18柱）Fig.3 Chromatogram of the test solution in separating glibenclamide from related substences using ASB C18column

6 结 论

本试验证明了色谱柱分类确实能够对实际样品测定中色谱柱的选择提供参考，可以提高分析时色谱柱的选择效率，节约选择色谱柱的时间。如果已知实验室中色谱柱的类型，应用现有色谱柱完成分析还可以节约资金，而且选择相同类型的色谱柱有利于不同实验室的数据交换。本实验也说明不同的色谱柱选择方法有所区别。以本实验为例，可以将2种色谱柱分类方法相结合，由于B型色谱柱差异较小，绝大多数B型色谱柱存在等同色谱柱，所以首先按照JONATHAN等［14］分类方法选出类型相同的色谱柱即本实验选出B型色谱柱，然后再利用DORA等［18］对硅胶基质色谱柱的分类方法，进一步对色谱柱进行分类，从而得到所需色谱柱。在今后的研究中，还应针对色谱柱的选择研究，探寻更加准确快速地找到满足实验要求的色谱柱的方法。

［1］ 李志伟，霍云霞，刘佳，等.HPLC法测定6－甲基尿嘧啶的含量及有关物质［J］.河北工业科技，2010，27（1）:32－35.

LI Zhiwei，HUO Yunxia，LIU Jia，et al.Determination of 6－methyluralil content and related substange in HPLC［J］.Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2010，27（1）:32－35.

［2］ 齐宗韶.色谱法在中国药典（2005年版）一部、二部中的应用［J］.中国药品标准，2007，8（1）:69－72.

QI Zongshao.The application of chromatography in Ch.P.（2005）vol.1and vol.2［J］.Drug Standards of China，2007，8（1）:69－72.

［3］ 刘丽芳.药品标准中HPLC法色谱条件的优化与系统适用性试验的重要性［J］.中国药品标准，2005，6（1）:3－6.

LIU Lifang.The optimum chromatogram conditions of HPLC and the importance of system suitability method in pharmaceutical standard［J］.Drug Standards of China，2005，6（1）:3－6.

［4］ 王明娟，李娅萍，胡昌勤.药品质量标准中色谱柱等因素影响分析结果的实例揭示［J］.药物分析杂志，2008，28（11）:1940－1944.

WANG Mingjuan，LI Yaping，HU Changqin.Examples of insufficiency of the stationery phase information described in official HPLC methods leading to different analytical results［J］.Chin J Parm Anal，2008，28（11）:1940－1944.

［5］ ROSA B，VICTORIA S N，JOSE B.Modeling retention in liquid chromatography as a function of solvent composition and pH of the mobile phase［J］.J Chromatogr A，2000，869:27－39.

［6］ VERVOORT R J M，DEBETS A J J，CLAESSENS H A，et al.Optimizationand characterization of silica－based reversed－phase liquid chromatographic systems for the analysis of basic pharmaceuticals［J］.J Chromatogr A，2000，897:1－22.

［7］ 李莉，徐海娥.在HPLC法测定保健食品及中药制剂中化学降糖药的含量［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（6）:1271－1272.

LI Li，XU Haie.Determination of auti－diaetic agents in traditional Chinese medicine and health products by HPLC［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2009，19（6）:1271－1272.

［8］ 黄作君，黎月玲，郑企琨，等.高效液相色谱法测定人血浆中格列苯脲浓度［J］.中国医院药学杂志，2004，24（1）:22－23.

HUANG Zuojun，LI Yueling，ZHENG Qikun，et al.Determination of glibenclamide in human plasma by HPLC［J］.Chin Hosp Pharm J，2004，24（1）:22－23.

［9］ 刘淑花，田华.高效液相色谱法测定消渴平胶囊中格列苯脲含量［J］.药物鉴定，2010，19（23）:24－25.

LIU Shuhua，TIAN Hua.Determination of glibenclamide in Xiaokeping capsules by HPLC［J］.China Pharmaceuticals， 2010，19（23）:24－25.

［10］朱俐，尹利辉，金少鸿，等.HPLC快速检测药品的研究思路及其在降糖类药品中的应用［J］.药物分析杂志，2013，33（3）:524－529.

ZHU Li，YIN Lihui，JIN Shaohong，et al.Research approach of rapidly determination by HPLC and the application in hypoglycemic drugs［J］.Chin J Pharm Anal，2013，33（3）:524－529.

［11］王明娟，李娅萍，杨亚丽，等.提高高效液相色谱法定性准确性的方法探讨［J］.药物分析杂志，2006，26（1）:102－106.

WANG Mingjuan，LI Yaping，YANG Yali，et al.A primary study of standardizing HPLC retention indices of pharmaceutical related substances［J］.Chin J Pharm Anal，2006，26（1）:102－106.

［12］王明娟，李娅萍，胡昌勤.硅胶基质C18柱的分类［J］.药物分析杂志，2006，26（10）:1521－1526.

WANG Mingjuan，LI Yaping，HU Changqin.Classification of silica－based C18columns［J］.Chin J Pharm Anal，2006，26（10）:1521－1526.

［13］张伟清，胡昌勤.反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用［J］.药学学报，2010，45（5）:555－559.

ZHANG Weiqing，HU Changqin.Theory of selectivity of RPLC C18column and its application［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2010，45（5）:555－559.

［14］JONATHAN J，GILROY B，JOHN W D，et al.Column selectivity in reversed－phase liquid chromatography V:Higher metal content（type－A）alkyl－silica columns［J］.J Chromatogr A，2004，1026:77－89.

［15］GILROY J J，DOLAN J W，SNYDER L R.Column selectivity in reversed－phase liquid chromatographyⅣ:Type－B alkylsilica columns［J］.J Chromatogr A，2003，1000:757－778.

［16］WILSON N S，GILROY J，DOLAN J W，et al.Column selectivity in reversed－phase liquid chromatographyⅣ:Columns with embedded or end－capping polar groups［J］.J Chromatogr A，2004，1026:91－100.

［17］DEHOUCK P，DORA V，HEYDEN V，et al.Characterisation of reversed－phase liquid－chromatographic cloumns by chromatographic tests:Comparing column classification based on chromatographic parameters and column performance for the separation of acetylsalicylic acid and related compounds［J］.J Chromatogr A，2004，1025:189－200.

［18］DORA V，VANDER Y，HEYDEN V，et al.Characterisation of reversed－phase liquid－chromatographic tests:Rational column classification by a minimal number of column test parameters［J］.J Chromatogr A，2003，1012:11－29.

［19］中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范（2010年版）［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products.Chinese SOP Pharmaceutical Analysis（2010 Edition）［M］.Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，2010.