海兰褐蛋鸡痘病毒的分离与鉴定

姜绍全 （山东省海阳市畜牧兽医站 265100）

王金亮 秦 燕 （山东省临沂市动物疫病控制中心）

禽痘病毒病主要发生于鸡和火鸡，鸽子偶有发病，鸭、鹅不易感。不同性别、年龄、品种的鸡均易感染。本病一年四季均可发生，尤以秋季和冬季多发。病鸡脱落的痘痂，为病毒散播的主要形式，皮肤或者粘膜上的伤口、蚊虫叮咬亦可传染该病，但不经健康皮肤及口腔感染。鸡群过于拥挤，鸡舍通风不良、阴暗潮湿，鸡群打架、啄毛、交配等造成的外伤，鸡群感染寄生虫，营养不良，维生素缺乏，饲养管理差等皆可导致该病的发生。若继发其他感染可引起大批死亡，尤其对雏鸡可造成极为严重的损失。2014年9月18号，海阳一蛋鸡养殖场送检一批12周龄疑似鸡痘病毒感染的海兰褐蛋鸡。本实验室从流行病学、解剖学和实验室诊断出发对该病进行了综合诊断，并成功分离出鸡痘病毒。

1 材料与方法

1.1 病料来源 海阳某养殖场的海兰褐蛋鸡群，于12周龄左右一些鸡只开始出现消瘦，下痢，精神沉郁，缩颈，食欲减退，个别有呼吸道症状，每日发病数量呈不断增长趋势并伴有零星死亡。剖检病鸡可见肝脏出血，胰脏萎缩，脾脏表面有大小不等的坏死点，喉头有黄色渗出物;腺胃肿大，腺胃乳头出血，肌胃角质层出现糜烂，肺脏出血。收集病变明显的肝、脾、肺组织作为病原分离的病料。

1.2 材料与试剂 9～12日龄SPF鸡胚购自山东省济南市家禽研究所，健康成年蛋鸡为本实验室饲养，未接种任何病毒。抗生素(注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素)购自山东鲁抗医药有限公司；PmD18-T 载体试剂盒购自TaKaRa公司；感受态DH5ɑ细胞由本实验室制备并保存。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 病料处理 无菌取病鸡肝脏、脾脏、肺脏，加入4倍体积的生理盐水震荡充分，反复冻融3次，离心，取上清，加入终浓度为1万IU的青、链霉素，4℃作用4h，待菌检阴性，于-20℃保存备用。

1.4 病毒分离 将上述准备材料接种于9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜(CAm)，采用侧面“开天窗”法，共接种15枚，每胚接种0.2ml；同时设置6枚接种等量生理盐水作为对照。连续观察一周，观察胚的死亡情况及死亡鸡胚绒毛尿囊膜变化，弃去24h以内的死亡鸡胚，收取死亡和未死鸡胚的绒毛尿囊膜。将绒毛尿囊膜病料处理，继续接种9日龄SPF鸡胚，盲传3代。

1.5 病毒的鉴定 病毒的PCR鉴定。（1）PCR引物设计：鸡痘病毒引物根据GenBank已发表序列用Primer Premier 5.0软件设计并由英潍捷基生物有限公司负责合成。引物序列如下：上游引物：ATACTTTACGATACA AACCT，下游引物：GTGCCTATGGAATCTGGT。（2）模板的制备：取第三代死亡鸡胚的尿囊膜放于离心管中剪碎，每管加入8ul蛋白酶K 、500ul 10% SDS震荡混匀，放入56℃水浴锅中过夜。次日，将消化好的组织离心，取上清约400ul转移至新的离心管中，加入等体积苯酚、氯仿抽提，震荡充分，12000r/min，离心10min，并重复此步骤一次。取上清约300ul加入2倍体积的无水乙醇混 匀，-20℃静置30min，离心弃上清。以预冷的75%乙醇洗涤2次：12000r/min，离心15min，弃上清，沉淀通风干燥，最后以50ul灭菌双蒸水溶解。（3）PCR反应体系：反应体系为20ul，2×Es Taq mastermix 10ul，上、下游引物各1ul，模板2ul，双蒸水6ul。基本反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳，紫外观察扩增片段的大小。

1.6 测序鉴定 按照DNA凝胶回收试剂盒的说明回收PCR产物，与PmD 18-T载体连接后，转入DH5ɑ E.coli 感受态细胞，挑取克隆子进行今夜PCR鉴定，将阳性克隆子送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，并与GenBank中发表的相关序列进行比较。

1.7 动物回归试验 按照病料处理方法处理第3代死亡鸡胚绒毛尿囊膜，以上清液作鸡冠划痕，每组10只，同时以无菌生理盐水以相同途径对对照组作鸡冠划痕。接种后每天观察接种鸡的划痕处变化及接种鸡的情况。

2 结果与分析

2.1 病毒分离 传至第3代时鸡胚死亡情况较为严重，死亡鸡胚绒毛尿囊膜明显增厚水肿，且尿囊膜上形成灰白色痘斑，而对照组鸡胚均生长良好。

2.2 病毒的鉴定 （1）PCR鉴定结果：利用合成的引物对第3代鸡胚绒毛尿囊膜病毒进行扩增，琼脂糖凝胶电泳可见在约306bp处有一条带，与预期一致(见图1)。而H9型禽流感病毒，呼肠孤病毒等家禽常见疾病的检测均为阴性。（2）测序结果：将扩增引物回收、连接转化、鉴定后测序，结果显示，该序列与GenBank中发表的鸡痘病毒p4b核心蛋白基因序列的同源性在90%以上。（3）动物回归实验：将病毒上清对健康鸡作鸡冠划痕，3～4d时，接种鸡的接种部位陆续出现出现明显的痘肿；而对照组鸡冠划痕处只有轻微结痂，无任何病变。

3 讨论

图1 PCR 鉴定电泳图

禽痘是家禽及鸟类的一种接触性传染病，扩散缓 慢。其特征是在羽毛稀少或无毛处有痘疹，或在口腔、咽喉等粘膜处形成纤维素性坏死性伪膜，易在大型鸡场造成流行，致使病鸡减食、消瘦，蛋鸡产蛋下降。鸡痘可分为皮肤型、粘膜型、混合型和败血型。一旦感染禽痘病毒，养殖业将会蒙受巨大损失，且目前为止禽痘病毒病尚无特效药物可以治疗，故而对该疾病的预防十分重要。鸡痘的预防除加强鸡群的卫生、管理等一般性措施外，较为可靠地方法是接种疫苗。接种鸡痘疫苗后，应于7～8d对接种鸡群进行抽查，检查局部是否结痂或毛囊有无肿胀。若局部出现反应则表示接种成功，否则应予补种。本研究结合临床症状、剖检变化和实验室诊断方法对一起疑似鸡痘病毒感染的病例进行了确诊并成功对鸡痘病毒进行了分离鉴定。首先对鸡群的发病情况进行大体了解：发病鸡精神沉郁，食欲减退，消瘦，并伴有零星死亡。剖检可见胰腺萎缩，腺胃水肿萎缩等症状。利用鸡痘病毒特异性引物可扩增出于预期基因片段大小一致的条带，测序、动物回归试验结果都表明此次病鸡确为鸡痘病毒感染所致。利用鸡胚绒毛尿囊膜方法接种病毒，盲传3代后收取死胚绒毛尿囊膜，经实验室方法检测可以确定此次成功分离出了鸡痘病毒。