利用正交试验法优选复合中草药提取物

陈恩保 刘文利 （山东省齐河县畜牧兽医局 251100）

由于环境中各种致病因素尤其是免疫抑制性致病因素的存在，严重影响了家禽机体的免疫功能和对疫苗的免疫应答效果，使得传染性疾病的防治变得非常困难。因此，预防传染性疾病的发生仅靠疫苗是不够的，需要采取包括增强机体免疫力在内的综合防制手段。而免疫增强剂正是通过非特异性途径来增强机体后天获得的非特异性和特异性免疫机能，这可能是解决该项难题的一条重要途径。为此，从益气、补血、滋阴、壮阳四个方面着手，精心筛选出硫酸修饰化黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖这四种分别具有此项功能的多糖组成复合制剂，以此复合制剂作为免疫增强剂，为了搞清这四种组分在整个组方中所起的作用以及各组分间的最佳用药配比，笔者以T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率为指标，应用正交试验法进行了研究分析。

1 材料与方法

1.1 试验用药物 黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、枸杞多糖，全部购自北京市药材公司，经含量测定分别为89.1%、73.7%、(苯酚—硫酸法)。

1.2 试验用鸡 商品海兰白蛋鸡，10日龄健康雏鸡。

1.3 正交试验设计 本试验采用L9(34)正交表进行设计[1,2]，将硫酸修饰化黄芪多糖(A)、当归多糖(B)、枸杞多糖(C)及淫羊藿多糖(D)作为4个试验因素，每个因素3个水平，各因素水平详见表1。

1.4 试验方法 按L9(34)正交表提供的配方设计9个试验组，另设一个空白对照组。具体方法是选择11日龄、体重相近的健康雏鸡100只，随机分为10组，每组10只，1-9组分别为按L9(34)正交表提供的9个不同配方的用药组，第10组为空白对照组即不用药组，连用5d后，分别在16日龄和21日龄抽取各组鸡5只，进行T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率试验。具体正交试验方案见表2。

1.5 T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率的测定 按照参考文献[3]进行检测。

表1 因素与水平

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

表2 L9(34)正交试验方案及试验结果(±SD)

表2 L9(34)正交试验方案及试验结果(±SD)

处理号 因素 T淋巴细胞 ANAE阳性率% B淋巴细胞 EAC花环率% A B C D 1 1 1 1 1 33.5±1.6 35.2±2.6 22.0±3.2 28.5±3.6 2 1 2 2 2 38.2±1.5 39.0±1.4 21.6±2.7 24.2±3.0 3 1 3 3 3 34.5±2.5 35.3±3.2 20.4±1.2 23.9±3.3 4 2 1 2 3 36.1±1.7 37.3±2.3 21.0±2.5 23.5±1.8 5 2 2 3 1 32.7±2.8 36.2±1.7 24.4±1.4 27.9±3.2 6 2 3 1 2 29.5±2.4 32.5±1.9 19.2±1.6 22.7±2.9 7 3 1 3 2 34.6±1.7 37.6±2.1 23.4±1.3 27.2±1.8 8 3 2 1 3 36.3±1.9 39.8±1.9 23.4±1.2 29.1±2.2 9 3 3 2 1 34.3±1.7 38.1±1.4 23.5±2.3 29.6±1.7 10 0 0 0 0 25.1±1.5 28.0±2.6 12.0±3.1 17.3±2.4

正交试验的结果详见表2。从表2可以看出，用正交试验法得到的9组不同的复合中草药提取物配方与空白对照组相比，都对T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率的提高有不同程度的促进作用，两者差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。

2.2 正交试验结果的直观分析 T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率的极差分析见表3。表3是分别在16日龄和21日龄时检测的T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率情况。根据所得极差R的大小顺序可知，A因素和B因素对T淋巴细胞ANAE阳性率的影响较大，D因素影响最小。

根据极差R的大小顺序可知，A因素和B因素对B淋巴细胞EAC花环率的影响较大，C因素影响最小。

表3 直观分析结果

2.3 正交试验结果的方差分析

表4 方差分析结果

（1）因为L9(34)正交表中的4列都已经安排因素没有空列。因此计算误差平均和，可用因素平方和中最小者作为误差平方和平均变动的估计值，但df误必须为无穷大[4]。（2）从方差分析结果可以看出，A因素和B因素对T淋巴细胞ANAE阳性率的影响较大，D因素影响最小。（3）A因素和D因素对B淋巴细胞EAC花环率的影响极显著，B因素影响显著，C因素影响最小。与极差分析的结果基本一致。

2.4 最优配方的筛选 综合以上结果可以得出，A因素是影响两者大小的重要因素，B因素次之，C和D两因素影响较差。进一步从节约生产成本考虑，所以该复合中草药提取物的最优组合为A3B2C1D1。

3 结论与讨论

（1）通过正交试验及统计分析，得到该复合中草药提取物的最优组合为黄芪多糖(A)、当归多糖(B)、枸杞多糖(C)及淫羊藿多糖(D)。（2）正交试验是一种适用于多因素多水平的试验设计方法，可以通过全部因素或主要因素、水平的组合试验，找出各因素、水平间的内在组合规律，达到与全面组合试验相似的效果，比较适合于制剂配方的筛选。应用正交试验的方法，分析中药复方各组分在整体组方中所起作用的大小以及各组分的最佳用药剂量，可以避免进行大量的拆方试验，从而大大缩短了中药组方研究开发的时间。但本方法的难点是怎样将中药复方的整体功效综合为一个量化的指标。（3）在家禽体内的免疫活性细胞中，T、B的数量与机体免疫功能的高低有着非常密切的关系，两者数量的增加反映了机体免疫力的提高，因此，T、B淋巴细胞的多少是机体全身免疫机能强弱的一个具体表现。本试验以T淋巴细胞ANAE阳性率和B淋巴细胞EAC花环率作为整个组方的疗效指标，基本上全面概括了整个组方的作用。（4）我们从众多中草药中，精心筛选出硫酸修饰化黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖这四种益气、补血、滋阴、壮阳类的中草药提取物组成复方制剂，用此复方制剂作为免疫增强剂来预防IBD，弥补了人们通常用中药散剂或单一中药提取物作为免疫增强剂来使用的缺点，该提取复合物适合于家禽各种体质，又可饮水使用，顺应当前家禽养殖规模化、集约化的发展趋势，方便省力，可节约大量人力、物力、财力和时间。中草药又具有别于其它类免疫增强剂的独特天然优势，而且它来源广泛，价格低廉，用此提取复合物作为免疫增强剂使用，具有重要的实际意义。

[1]莫惠栋.农业试验统计[m].北京: 中国农业出版社, 1994.

[2]杨进, 陈建.用正交试验法研制盐酸洛美杀星滴耳剂[J].中兽医医药杂志, 2001, 20(3): 9-11.

[3]崔治中.兽医免疫学实验指导[m].北京: 中国农业出版社, 2006.

[4]于立芬.数理统计方法[m].上海: 上海科学技术出版社, 2005.