张家口地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌的分离鉴定及中药抑菌试验

2015-03-18王海凤

中国兽医杂志 2015年5期

王海凤

（河北北方学院动物科技学院，河北张家口 075000）

近年来，张家口地区奶牛业生产态势良好，带动了地方经济的快速发展，但奶牛生殖系统疾病也随之增多，其中子宫内膜炎占相当大比例，严重影响了奶牛的繁育性能和产奶量，严重者可因丧失经济价值而被淘汰，给养殖户造成的危害非常严重，经济损失巨大。

国内外学者对患子宫内膜炎奶牛子宫内菌群的分离鉴定研究表明，引起子宫内膜炎的主要原因是病原微生物的感染[1]。包括细菌、真菌、支原体、病毒和寄生虫等。临床上多使用抗菌药物进行治疗，由于耐药菌株不断产生，不但疗效不佳，而且导致用药量越来越大，后者又使治疗成本增加，还会引起乳产品中药物残留超标、带来食品安全隐患。中药在治疗奶牛疾病方面具有巨大的潜力，在奶牛饲料中应尽量添加中药饲料添加剂，对影响牛奶质量的主要疾病要进一步推广中药防治。

由于本病病原菌的种类随地域不同而有较大差异，张家口及其周边地区奶牛子宫内膜炎发病率及主要致病菌缺乏相关资料，给临床防治奶牛子宫内膜炎造成很大难度。本试验针对在张家口地区采集了疑似病例的奶牛子宫30 份（将30头疑似病牛屠宰后取出整个子宫）进行主要病原菌的分离和鉴定，确定患病奶牛发生子宫内膜炎后主要致病菌，然后测定中药对分离菌株的体外抑制作用，筛选治疗奶牛子宫内膜炎敏感性的药物，为有针对性地制定本地区奶牛子宫内膜炎的防治措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 中药制备中药黄芩、硼砂、连翘、蒲公英、淫羊藿、益母草、红花、当归、金银花、板蓝根、苦参、夏枯草等，购自张家口华佗药房。

中药煎液制备：各中药用水浸泡12 h 后，将以上每种单药加蒸馏水至中药完全浸没，置于电炉上急火煮沸，沸腾后开始计时，文火煎熬30 min后倒出药汁，再加水同样煮沸1 次，将两次的煎液混到一起，纱布过滤后浓缩至20 mL，制成含药量为1 g/mL 的煎剂，4 ℃储存备用。

1.2 病料采集按照临床型奶牛子宫内膜炎的诊断标准，在张家口坝上地区屠宰场将送去久配不孕即将淘汰的奶牛选出30 头，经过问诊和直肠检查暂定为子宫内膜炎。奶牛屠宰后立即将子宫整体取出并采集子宫分泌物送实验室进行病原菌培养鉴定。

1.3 病原菌分离鉴定将采集的子宫分泌物逐个接种于肉汤培养液，37 ℃增菌培养24 h；然后将增菌培养液划线接种于普通琼脂培养基，37 ℃培养24 h；挑取单菌落在普通琼脂培养基上划线分离、培养。如此反复，直到培养基上的菌落特征相同时，再挑取单个菌落涂片，革兰染色后镜检；根据菌落形态、菌体大小和染色特征，分别接种于鲜血培养基中进行纯培养，然后将菌株分别接种于血琼脂和麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、S.S.琼脂培养基等鉴别培养基中进行纯培养。长好后用塑料袋装好密封放于4 ℃冰箱中保存，进行细菌的生化鉴定。菌种的保存则用含20%甘油的肉汤冷冻，-70 ℃保存。

将分离到的菌株逐个进行生化反应试验[2]，主要包括以下几方面试验内容：革兰染色、溶血性、形态观察、糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验（M.R.试验）、乙酰甲基甲醇试验（V-P 试验）、硝酸盐还原试验、硫化氢试验。最后根据菌落形态、革兰染色、镜检结果和生化反应结果综合分析，鉴定各菌株。具体细菌的鉴定参照《常见革兰阳性菌的简易鉴定方法》、《伯杰细菌鉴定手册》和《临床细菌学》中的细菌分群方法进行。

1.4 中药抑菌试验采用平板打孔法[3]。分别取稀释待测菌液于少量生理盐水中制成0.5 号麦氏标准菌液，用灭菌棉球将待检细菌混悬液均匀涂布于平皿培养基表面，再用直径5 mm 的无菌打孔器在每个平皿内均匀打5 个孔，挑去孔内琼脂，火焰加热封底后注入各中药液，以刚刚注满为准，37 ℃培养18～24 h 后，测定抑菌圈直径。对于抑菌圈直径过大的或是没有的进行补做。

判断标准：由于目前没有关于中药抑菌圈直径同药物敏感性的关系，所以具体抑菌试验结果只能用抑菌圈直径表示，根据国家药政管理局1995 年制定的中新药申报指南中规定，中药采用打孔法，中药的抑菌圈直径超过8 mm 者可判定为抑菌作用。

2 结果

2.1 患病奶牛病原分布和感染情况本试验对30 个奶牛子宫分泌物进行细菌分离，共分离出6种主要病原菌，93 株，分别为大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，分泌属化脓菌，蜡样芽孢杆菌，沙门菌。单一感染和混合感染同时存在，混合感染高于单一感染（表1）。试验表明，葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为奶牛子宫内膜炎的主要致病菌。且从病料来源看（30 头淘汰奶牛全部来自张家口市坝上周边地区），该结论可以代表张家口市坝上周边地区奶牛子宫内膜炎的真实性。

表1 病原菌各分离菌株的种类及部分特性

2.2 病原培养特性、染色特性和生化鉴定经无菌方式采取的不同奶牛子宫内容物样品，经实验室初步分离、纯化后，涂片，镜检，根据菌落的培养时的形态特征，显微镜下细菌的形态特征，初步确定的细菌是革兰阳性或阴性细菌，然后进行生化鉴定，6 种病原菌生化鉴定结果见表2。

表2 生化鉴定结果

2.3 中药的抑菌效果采用打孔法进行单味中药的药物敏感性试验，对于不同的细菌，根据其不同的培养特性，采用不同的培养基，在其培养基上打孔后，注入药液后，按照其特性，严格进行培养，对6 种细菌进行13 种单味中草药的体外抑菌试验，结果见表3。多数单味中药对6 种细菌均有程度不同的抑制作用。其中以黄芩、硼砂、连翘、蒲公英、淫羊藿、大黄、丹参的抑菌效果较好。以单味药对各种细菌抑菌圈直径的平均值比较，排在前6 位的是淫羊藿（9.97）、硼砂（9.62）、黄芩（9.55）、蒲公英（9.5）、丹参（9.07）、连翘（8.98）。

3 讨论

普遍认为子宫内膜炎的直接病因是产后各种病原微生物的感染所引起的，奶牛子宫内膜炎病原微生物比较复杂，不同地区不同情况下分离到的细菌种类和比例也有差异[4]。本试验对疑似子宫内膜炎奶牛病原细菌进行分离，张家口地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌为大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，分泌属化脓菌，蜡样芽孢杆菌，沙门菌等。分离到的细菌大多为广泛存在于环境中及畜体内的常见菌，其中有些是条件性致病菌，可见子宫内膜炎是因奶牛产后体质虚弱、免疫力下降，环境中及畜体内病原微生物乘机侵入所致，这与我们进行的病因学调查中发现奶牛场中存在的接产或人工授精时消毒不严及牛场卫生条件较差的状况相吻合。在所检验的30 头患病奶牛中，单一感染和混合感染同时存在，主要为多种细菌的混合感染，这与地区性饲养管理水平、环境因素有极大的关系，同时也与没有及时进行早期诊断治疗有关。一旦一种病原微生物感染后，由于未能及时采取措施和早期治疗，造成子宫内膜和机体的抵抗力下降，极易诱发各种条件性病原微生物的继发感染。由于混合感染的比例极高，导致治疗上的难度增加，从而使治愈率下降。这也是当前张家口奶牛子宫内膜炎临床治愈率低下的主要原因之一。本试验中首先通过单味中药的抑菌试验，筛选出抑菌效果较好的中药7 种：黄芩、硼砂、连翘、蒲公英、淫羊藿、大黄、丹参。