丹参酮增强化疗药物拮抗黑色素瘤效果的研究

于 泳 张林林 秦治刚 武月婷 谢凤洋 杨 煜 (吉林大学公共卫生学院，长春 130021)

上世纪的环境污染导致的臭氧层变薄，使过多对人类有害的紫外线到达地面。人类发生皮肤癌的概率大大增加。目前治疗皮肤癌的主要手段是手术切除，加上化疗药物的使用。化疗药物的副作用之一是导致机体免疫功能下降，容易出现复发。如何有效治疗皮肤癌并防止复发是治疗中需要着重考虑的问题。如何在进行抗肿瘤治疗的同时，保护机体的免疫功能，产生事半功倍的效果，是目前肿瘤治疗研究的热点问题。近年来，中药制剂在抗肿瘤中的应用备受关注。丹参酮是一种从丹参中分离出来的菲醌类衍生物，有研究提示，丹参酮能够在体内外诱导肿瘤细胞的凋亡［1，2］，并且能够改善免疫功能。为此，本文利用丹参酮和卡铂联合用药拟探讨丹参酮对抗肿瘤药物的促进作用，为临床应用中药制剂进行抗肿瘤治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 丹参酮、卡铂购自上海宝曼科技有限公司;B16 黑色素瘤细胞株购于中科院上海细胞所;RPMI1640 购自美国Gibco 公司;胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。动物实验为SPF级C57BL/6N 小鼠40 只雌雄各半，体重18～22 g，购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心。

1.2 B16 细胞株 培养于含10%的胎牛血清、青霉素0.06 g/L、链霉素0.13 g/L 的RPMI1640 培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，成贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 肿瘤模型的建立 取体外培养对数生长的B16 黑色素瘤细胞配置成浓度为5 ×106ml-1的单细胞悬液。32 只(雌雄各半)C57BL/6N 小鼠，从小鼠右下肢外侧注入0.2 ml 细胞悬液即每只小鼠皮下注入106/只单细胞悬液后随机分为4 组即:模型组、丹参酮组、卡铂组、丹参酮+卡铂组，每组8 只小鼠，另外设置8 只正常小鼠为空白组。次日起32 只小鼠每只每日用药，模型组0.2 ml 生理盐水腹腔注射、丹参酮组0.5 g/kg 丹参酮灌胃、卡铂组0.5 g 卡铂腹腔注射(连续给药4 d，停药4 d，再继续给药4 d，停药4 d，该给药方式一直持续至杀死动物)、丹参酮+卡铂组0.5 g/kg 丹参酮灌胃加0.5 g 卡铂腹腔注射(卡铂给药同卡铂组小鼠)、空白组不做任何处理。每两天测量小鼠体重;种植细胞处每日观察，记录瘤体的大小。第21 日称体重，眼球取血，脱臼处死小鼠，分离右下肢外侧瘤体。

1.4 组织学观察 将分离取出的瘤体称重，计算肿瘤体积(计算公式为V=ab2/2，a 为肿瘤长径，b 为肿瘤短径)，瘤体-80℃保存。

1.5 统计学分析 所有数据均采用SPSS17.0 专业软件进行统计分析，所有数值均采用± s。P＜0.05 被认为数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮下种植瘤质量与体积变化 各组小鼠皮下种植瘤质量与体积变化，注射药物21 d 后处死小鼠，模型组的种植瘤成瘤率、瘤体质量、瘤体体积全部明显高于丹参酮组、卡铂组、丹参酮和卡铂联合用药组。其中丹参酮和卡铂联合用药组的成瘤率、瘤体质量、瘤体体积明显低于丹参酮组、卡铂组，P＜0.05。各组小鼠成瘤率、瘤体体积的比较见表1。

2.2 丹参酮和卡铂联合应用对肿瘤的抑制作用 从表1、图1、2 可见，单纯应用卡铂或丹参酮对肿瘤具有抑制作用。丹参酮和卡铂联合用药抑制肿瘤效应明显加强，肿瘤生长速度明显缓慢于其他组，肿瘤质量也低于其他组，如图2 显示。联合用药肿瘤潜伏期亦比其他组显著延长，具体的各组肿瘤潜伏期的比较见图3。

表1 各组小鼠成瘤率，瘤体质量和瘤体体积比较Tab.1 Comparison of tumor formation rate，tumor weight，tumor volume in mice from different groups

2.3 丹参酮和卡铂联合用药对小鼠体重的影响 从图4 可见，丹参酮和卡铂联合用药小鼠体重的增长显著快于单一用丹参酮或卡铂小鼠的体重增长。单一应用丹参酮和卡铂的小鼠体重增长速度显著快于模型组小鼠，模型组小鼠的体重增长较缓慢。模型组体重体明显低于其他治疗组小鼠体重(P＜0.05)，各组小鼠的平均体重增长情况比较，见图5。

图1 各组小鼠种植瘤平均体积比较Fig.1 Comparison of tumor volume in mice from different groups

图2 各组小鼠种植瘤平均质量比较Fig.2 Comparison of tumor weight in mice from different groups

图3 各组小鼠种植瘤平均潜伏期比较Fig.3 Comparison of tumor latency in mice from different groups

图4 各组肿瘤照片Fig.4 Tumor size comparison among different groups

图5 各组小鼠体重增长趋势比较Fig.5 Comparison of body weight growth of mice among different groups

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种恶性程度极高的肿瘤，恶性黑色素瘤浸润、转移能力强，扩散迅速，早期即可发生转移，近年来，其发病率和死亡率都急剧上升，呈现出年轻化趋势［3］。黑色素是由蛋白质、醌和吲哚物质结合的高分子聚合物，决定了人体肤色和毛发颜色，分布于人表皮细胞中。酪氨酸是一种非必需氨基酸，是制造黑色素的主要原料，经过酪氨酸酶的催化反应后生成3，4-二羟基苯丙氨酸(LDOPA)［4，5］。酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是黑色素合成的主要限速酶［6］，它不仅决定黑色素合成的速率，还是黑色素成熟的主要标志［7］。生成的L-DOPA 在活性氧的参与下经过多次反应生成成熟黑色素颗粒［8］，经过运输到达表皮。本文采用小鼠B16黑色素瘤细胞做动物模型，探讨丹参酮与卡铂用黑色素瘤形成，增殖的抑制作用。丹参酮可以改善心、肝、肺因缺血的再灌注损伤，调节免疫应答作用［9］。同时对肿瘤细胞有诱导分化、凋亡作用［10］。其中对Bcl-2 基因表达有降低作用，对P53、Bax、fas 基因有增强表达作用［11-13］，抑制P53 基因的突变进而抑制肿瘤细胞的成长［14］，Bax、fas 是凋亡因子，拮抗Bcl-2 使细胞发生凋亡，可使Bcl-2 基因蛋白形成异源二聚体，加速肿瘤细胞的死亡［15］。卡铂分子通过破坏DNA 使肿瘤细胞无法进行自我复制从而抑制肿瘤细胞的生长［16］。单独使用抗肿瘤药物由于其毒性大，以铂类药物为基础联合用药可以改善症状、生存质量，降低药物毒性。

总之，丹参酮、卡铂联合用药可以抑制B16 黑色素瘤的增殖、转移。抑制B16 黑色素瘤细胞内黑色素的合成，降低黑色素瘤的发生率。联合用药强化了化疗药物的效果，同时降低了单独使用化疗药物的毒性作用，联合用药具有深远意义，值得进一步研究开发。

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