沉默GRP94 表达对肺癌A549 细胞增殖能力的影响①

邓 雨 杜 铭 (重庆医科大学附属第一医院胸心外科，重庆 400016)

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其中其发病率和死亡率增长最快［1］。非小细胞肺癌占总量的80%，由于缺乏有效的早期诊断及综合治疗，其5 年生存率很低［2］。而癌细胞的恶性增殖是治疗肺癌患者的一大难题原因，因此对肺癌细胞增殖过程中发挥重要作用的因子的研究对于肺癌的治疗及预后具有重要意义。

通过化学合成siRNA 特异性下调靶基因的表达，而进行的分子靶向治疗是近年来的研究热点［3］，GRP94 基因是内质网的丰度蛋白之一，作为内质网分子伴侣参与了蛋白质的合成与降解。研究表明GRP94 在乳腺癌、胰腺癌及肺癌等多种肿瘤中呈高表达趋势，且与肿瘤化疗药物的耐药性密切相关［4-7］。本研究在mRNA 及蛋白水平分别检测了分子伴侣GRP94 在肺癌细胞系中的表达情况，进一步针对GRP94 基因化学合成小干扰RNA，研究其对人肺腺癌A549 增殖能力的影响极其可能机制，为探讨GRP94 在肺癌增殖过程中的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI1640 培养基、胎牛血清购自Gibco 公司;兔抗人cyclinD1 单克隆抗体购自CST公司;兔抗人c-myc 单克隆抗体购自Bioworld 公司;兔抗人GRP94 单克隆抗体购自Abcam 公司;脂质体转染试剂Lipofectamine2000 购自Invitrogen 公司;Total RNA 提取试剂盒购自OMEGA 公司;蛋白提取试剂盒和ECL 发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 siRNA 的合成 根据GRP94 基因在Genebank中的序列(NO:NM-003299.2)设计靶向Grp94 基因的siRNA 序 列(UACUGUACCAUCCACAUCA)，siRNAnegative control 序列，由上海吉玛制药技术有限公司合成，干粉siRNA 用DEPC 水稀释成20 μmol/L，-20℃保存。

1.3 细胞培养及转染 人肺癌细胞(A549、H1299、H226、H460)及肺支气管上皮细胞(BEP-2D，HBE)由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心保存。经复苏后于37℃，5%CO2孵箱中培养，A549 细胞转染前24 h，以2 ×105个/孔细胞接种于6 孔培养板中，当细胞达80%～90%融合时，参照Lipofectamine2000产品说明书，分别将siRNA-NC 和siRNA-GRP94 转染至六孔培养板中，转染6 h 后更换新鲜培养基。

1.4 qRT-PCR 法 收集转染48 h 后各组细胞，按照Total RNA 提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。采用SYBR Green 法进行qRT-PCR，用于扩增GRP94 cDNA 的上游引物:5'-GGGAGGTCACCTTCAAGTCG-3'。下游引物:5'-GGGTGTAGACGTGGAGCTC-3';β-actin 上游引物:5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'，下游引物:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，反应条件为:95℃3 min;95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，共39 个循环;同一实验重复3 次，实验数据分析采用2-ΔΔCT法计算。

1.5 Western blot 法 分别收集转染72 h 后各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。加入5 × SDS 上样缓冲液100℃，变性5 min;每孔40 μg，80V 恒压SDS-Page 电泳，250 mA恒流2 h 冰浴，电转至PVDF 膜，5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗GRP94(1∶1 000)，β-actin (1∶3 000)，c-myc (1∶500)，cyclinD1 (1∶1 000)4℃过夜，次日TBST 漂洗5 min ×5 次，加入HRP 标记的二抗(羊抗兔1 ∶4 000)室温孵育1 h，TBST 漂洗10 min×3 次，ECL 化学发光显影。

1.6 CCK-8 测定细胞的生长增殖曲线 将转染24 h 后的各组细胞消化收集，计数，以每孔3 000 个/100 μl 接种于96 孔板中，待细胞贴壁后记为1 d 分别在1、2、3、4、5 d 时间点分别加入10 μl 的CCK-8溶液，37 度孵育1.5 h 后在波长450 nm 处检测其光密度值。

1.7 平板集落实验检测细胞克隆形成能力 收集转染24 h 后的各组细胞，计数，以每孔1 000 个/2 ml 接种于6 孔培养板中，2～3 d 换液，10 d 后取出，PBS 漂洗3 次，加入预冷分甲醇室温固定30 min后，0.1%结晶紫染色。

1.8 统计学分析 采用SPSS13.0 统计软件，各组实验数据均以±s 表示，配对组间采用t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR、Western blot 分别检测细胞在肺癌细胞系及肺支气管上皮细胞系中的表达 结果显示:人肺癌细胞系A549、H1299、H460、H226 中GRP94 mRNA 及蛋白表达水平明显高于肺支气管上皮细胞系HBE、BEP-2D，尤其GRP94 在A549 细胞中表达最高(P ＜0.05，P ＜0.01)。见图1、2。

图1 qRT-PCR 检测不同肺癌细胞及肺支气管上皮细胞中GRP94 mRNA 的表达水平Fig.1 Expression of GRP94 mRNA detected by qRTPCR in four lung carcinoma cells and two lung bronchial epithelial cells

图2 Western blot 检测不同肺癌细胞及肺支气管上皮细胞中GRP94 蛋白表达水平Fig.2 Expression of GRP94 protein detected by Western blot in four lung carcinoma cells and two lung bronchial epithelial cells

2.2 Real-time PCR、Western blot 分别在mRNA和蛋白水平验证GRP94siRNA 沉默效果 结果显示:siRNA-NC 组中GRP94 基因的相对表达量明显高于siRNA-GRP94 组，差异具有统计学意义(P ＜0.01)，见图3、4，说明GRP94 基因被有效沉默。

2.3 沉默GRP94 对A549 细胞增殖能力的影响通过CCK-8 法检测细胞贴壁后1、2、3、4、5 d的光密度值，绘制生长曲线，结果显示，与siRNANC 相比，siRNA-GRP94 组中细胞生长速率明显下降，说明沉默GRP94 对A549 细胞生长有抑制作用，差异具有统计学意义(P ＜0.05)，见图5。

2.4 沉默GRP94 对A549 细胞克隆形成能力的影响 平板集落实验显示，与siRNA-NC 组相比，siRNA-GRP94 组细胞克隆数明显下调，说明沉默GRP94 抑制了A549 细胞的克隆形成能力，差异具有统计学意义(P ＜0.05)，见图6。

2.5 沉 默GRP94对肺癌A549细胞c-myc、cyclinD1 表达的影响 Western blot 检测结果显示，siRNA-GRP94 组c-myc、cyclinD1蛋白表达水平明显低于siRNA-NC 组(图7)，说明沉默GRP94基因表达的同时能抑制c-myc 和cyclinD1 的表达。

图3 Real-time PCR 检测GRP94mRNA 表达水平Fig.3 Expression of GRP94 mRNA detected by Real-time PCR

图4 Western blot 检测GRP94 蛋白表达水平Fig.4 Expression of GRP94 protein detected by Western blot

图5 CCK-8 测定沉默GRP94 基因表达对A549 胞的生长影响Fig.5 A549 cells were transfected with NC or GRP94 siRNA and cell growth was evaluated by CCK-8 assay

图6 平板集落实验检测沉默GRP94 对A549 细胞克隆形成能力的影响Fig.6 Clonogenic capacity of silencing GRP94 expression in A549 cells were detected by colony formation assay

图7 沉默GRP94 对cyclinD1、c-myc 蛋白表达的影响Fig.7 Expression of cyclinD1 and c-myc protein detected by Western blot

3 讨论

GRP94 基因是HSP90 家族成员之一，调节细胞的结构产生内质网应激进而诱导细胞凋亡［8，9］。研究发现，GRP94 的表达水平与多种肿瘤的细胞分化程度呈负相关，与临床分期呈正相关趋势［10，11］。姚元春等［12］的研究表明在人胃癌组织中GRP94 的阳性表达率明显高于癌旁组织，且随着肿瘤的大小表达发生变化，肿瘤体积越大，表达越强，提示我们分子伴侣GRP94 参与了肿瘤细胞的生长过程，而GRP94 在肺癌细胞中的研究鲜为人知。本研究检测了GRP94 在肺癌细胞及肺支气管上皮细胞中的表达，发现GRP94 在肺癌细胞中呈高表达，且在A549 细胞中表达最高。同时采用RNAI 技术特异性下调GRP94 表达，观察在肺癌A549 细胞株的增殖能力的变化，结果显示，敲降GRP94 基因后，A549细胞增殖能力明显下降，克隆形成能力明显降低，说明高表达GRP94 与肺癌的恶性增殖紧密相关。而沉默GRP94 表达后，c-myc、cyclinD1 表达明显受到下调，提示GRP94 可能通过影响其表达参与调控肺癌的增殖能力。

GRP94 可能通过不同的途径调节肿瘤的发生发展，Tramentozzi 等［13］研究发现GRP94 依赖PI3K/AKT 信号通路的活化来促进血管生成。有资料表明，GRP94 可能靶向LRP6 膜蛋白活化wnt/β-catenin 信号通路参与了肿瘤的发生和发展［14，15］，提示我们在肺癌中高表达的GRP94 可能通过激活wnt/β-catenin、PI3K/AKT 信号通路协同调节下游cyclinD1、c-myc 等关键分子的表达来促进肺癌的增殖能力，进而影响肺癌的发生发展。此外，本研究为体外实验，GRP94 基因对在体内肺癌的作用仍需进一步研究。

综上所述，肺癌中高表达的GRP94 参与了肺癌的发生发展，通过检测GRP94 的表达量将可能作为肿瘤生物学行为的生物指标。随着对GRP94 基因功能研究的完善，其必将成为诊断和预测肺癌的分子标志物和抗肺癌增殖的生物治疗靶点。

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