糖化血红蛋白检测方法研究

刘　磊，王安杏，王化杰，徐文斌，张　敏

糖化血红蛋白检测方法研究

刘磊，王安杏，王化杰，徐文斌，张敏

摘要:目的，血红蛋白与葡萄糖通过非酶促反应形成糖化血红蛋白，在医学上糖化血红蛋白的检测作为诊断的重要指标。方法，葡萄糖常规分离血红蛋白的方法很多，本文通过一种简单、快速，分离糖化血红蛋白的方法，等电聚焦分离检测糖化血红蛋白。结论，通过等电聚焦的方法对糖化血红蛋白进行分离，根据朗伯-比尔定律，在一定范围内，蛋白浓度与光密度(OD)值呈线性关系，从而计算出糖化血红蛋白的含量，本方法应用于糖化血红蛋白的定量研究具有重要的意义。

关键词:糖化血红蛋白;等电聚焦;检测

人类的血红蛋白(Hemoglobin, Hb)是由血红素(Heme)和珠蛋白(Globin)组成的球形大分子化合物。每个血红蛋白分子含有4条珠蛋白肽链，每个肽链结合一个含有亚铁血红素，形成具有四级空间结构的四聚体。人类珠蛋白肽链有两大类，即α类链和非α类链，非α类链包括β、δ、ε等。不同血红蛋白肽链的构成也有差异。正常成年人的血红蛋白主要由血红蛋白HbA(α2β2)组成，其中HbA又可分为非糖化血红蛋白HbA0和糖化血红蛋白HbA1。其中 HbA1c是糖化血红蛋白HbA1主要成分，是总糖化血红蛋白GHb分子中最有特征性的成分[1]。

作为一种转录后的血红蛋白，HbA1c与正常血红蛋白的分离研究早在1958年开始。Huisman等利用羧甲基纤维素色谱柱，在研究蛋白种类时发现了一种有别于正常血红蛋白的组分，并将其命名为HbA1c。1968年Bookchin等在对HbA1c的化学结构研究中，发现这种蛋白的β链末端结合葡萄糖分子。1975年Bunn首次确定了这种组分就是色谱法中发现的HbA1c并且提出了人体内生成HbA1c的非酶促反应途径。次年Koenig和Cerami 首次发现HbA1c与糖尿病患者的血糖水平控制成正相关[2]，从此HbA1c作为了一种重要的标记物，应用于作为糖尿病的临床诊断标准。

1糖化血红蛋白的测量方法

1.1　GHb的检测方法

GHb的测定方法有很多[3-4]，基本上可分为两类：一类是根据血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析法、免疫法和酶法等；另一类是基于GHb和Hb的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法。这些测量的方法各有优缺点。根据各种糖化血红蛋白所带的电荷不同，本实验以等电聚焦的方法为例，对血红蛋白进行了初步分离。

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)[5-6]，是非常重要的一种分离方法，在毛细管中，以高压电场力为驱动力，根据每种分离物质的等电点差异，较为高效、快速的分离技术(见图1)。通过对毛细管及其填充物进行修饰或改进，可以分为电泳型、阵列式以及芯片式几种不同的分离模式。根据毛细管填充物的不同，列出了四种电泳型的分离模式，其中毛细管等电聚焦电泳得到的蛋白区带很窄，但蛋白的浓度较高，非常有利于糖化血红蛋白的分离和检测。

图1　毛细管电泳装置原理图

1.2　基于CIEF的糖化血红蛋白检测

传统毛细管等电聚焦电泳(CIEF)，将载体两性电解质、分离样品等混合物注入毛细管内，在两端加上直流电压时，两性电解质可以形成一定范围的pH梯度，每种组分根据其等电点(PI)不同，等电点与pH梯度相同时，样品停止运动，从而使各组分达到分离的目的。作为CIEF的核心部件，目前使用的常规毛细管，具有金属杂质含量低、吸附相对较小的优点。由于管径很小，在进行IEF分离时通过的电流值和随之产生的焦耳热也越小。使用内径极小的毛细管作为分离介质，能够较大提高热的扩散效率，从而达到提高分离效率。因此CIEF可以获得高分辨的，快速的蛋白质分离。更重要的是相比常规的平板凝胶电泳，CIEF具有重要的优点：分离效率提高，复杂样品的分离过程时间短。这些优点，在一定程度上也推动了糖尿病诊断中的临床研究。

但毛细管电泳的主要缺点之一是分析通量太小，不能同时分离多个样品，因此在常规分析应用中存在不足。阵列毛细管电泳因其速度快、通量大而在基因测序方面发挥了极大的作用。本实验根据在毛细管中进行糖化血红蛋白的分离(图2)[7-8]，分离后的条带进行全柱成像(图3)[9-10]。

图2　糖化蛋白的毛细管等电聚焦电泳示意图

图3　全柱扫描检测及全柱成像检测

2实验步骤与结果

2.1　准备样品

毛细管加入两性电解质及不同浓度的血红蛋白，加压分离。

测量前，将样品放好，调整CMOS位置及透镜组上下间距，保证样品图像水平且清晰；拿出样品，取空白图像做为对照；依次放置不同浓度的样品，得到不同样品的结果；

2.2　血红蛋白条带的OD值与相对位置Position之间的关系

光密度(optical density, OD)，定义为光线通过样品前入射光强与该光线通过该样品后透射光强比值的对数，即

(2-1)

公式(2-1)中OD为光密度，I0为入射光强度，I1为透射光强度。将空白图像的灰度值作为初始光强I0，放上样品后的光强作为I1，通过matlab数据处理软件编程，可得图像上所有象元的OD值与像素Pixel之间的关系。由图3可以看出：OD值的基线水平大概在0～0.18之间，即蛋白条纹没有聚焦的地方也存在吸收。除了毛细管之外的地方由公式可知为OD=0。其中有些地方OD>0，可能是毛细管内外径之间光线偏折带来的影响。而毛细管内部的蛋白条纹上下含量有差异，吸收情况也会不同，所以会呈阶梯型上升状态，其最大包络线应为蛋白吸收最大的情况。

为精确表示蛋白条纹的吸收，取图3.1中聚焦蛋白条纹灰度曲线最大44组数据作参考，做平均处理能有效去除探测器的噪声使OD曲线相对比较平滑，并且根据象元尺寸换算可以得到OD值与相对位置Position之间的关系(单位：mm)：

Positon=0.0022×Pixel

(2-2)

图4　OD值与位置Position之间的关系

2.3　血红蛋白条纹的OD值与浓度之间的关系

根据朗伯-比尔定律可知，当一束波长为λ的平行光通过均匀的非散射的吸光样品溶液后，光密度(吸光度)与样品的长度和吸光物质微粒数目(溶液的浓度)的乘积成正比，即

(2-3)

公式(2-3)中，λ为单色光的波长，K为比例常数，x为通过样品的长度，c为样品的浓度。在图3.2中找到每一种蛋白浓度下，4种不同蛋白条纹的最大OD值，做4条蛋白条纹的OD值随浓度的拟合曲线：由拟合曲线可看出，HbA1c与浓度的线性关系最好，拟合度为97.38%。这将对糖化血红蛋白检测提供参考。

图5　OD值与浓度之间的关系

3结论

通过以上实验，在毛细管中，对血红蛋白进行了分离，分离的方法是等电聚焦，根据血红蛋白的亚基不同，每种糖化的血红蛋白所带的等电点也不相同，从而实现分离，最后根据等电聚焦条带的光密度不同，从而实现定量，从这个意义上来说，等电聚焦对血红蛋白进行分离，然后进行定量，具有可行性。这将为以后的定量研究提供了参考。

[参考文献]

[1]宋银丹，段勇. 糖化血红蛋白检测标准化的研究进展[J].实验与检验医学，2013,31 (2): 108-110.

[2]雷纯刚. 糖化血红蛋白检测的临床价值[J].医学检验与临床，2011,22(4)：110.

[3]吕志贵，高绪锋.糖化血红蛋白及其测定方法的研究进展[J].检验医学与临床，2013,10(7)：862-864.

[4]严芝光，钟东.糖化血红蛋白的检测技术与临床应用进展[J].检验医学与临床，2012,9(6)：714-716.

[5]袁倬斌,尚小玉,张君. 毛细管电泳及其在环境分析中的应用进展[J]. 岩矿测试，2003,2(22):144-150.

[6]杨春等.毛细管等电聚焦电泳技术进展[J].色谱，2003,21(2):121-125.

[7]F Galacteros, K Kleman, J Caburi-Martin, isoelectric focusing Cord blood screening for hemoglobin abnormalities by thin layer.blood,1980(56): 1068-1071.

[8]Fariba Raisi,Phillip Belgrader,David A. Borkholder,Microchip isoelectric focusing using a miniature scanning detection system.Electrophoresis , 2001(22):2291-2295.

[9]Xing-Zheng Wu, Jiaqi Wu,Janusz Pawliszyn.Whole-Column-Imaging Detectionfor Capillary Isoelectric Focusingand Capillary Electrophoresis. Chromatography.,2011(19)526-544.

[10]Mao Y, Li Y, Zhang X. Array based capillary IEF with a whole column image of laser-induced fluorescence in coupling to capillary RPLC as a comprehensive 2-D separation system for proteome analysis. Proteomics ,2006(6):420-426.

责任编辑：刘海涛

收稿日期：2015-01-13

作者简介：刘磊，安徽职业技术学院教师，中国科技大学博士研究生，研究方向：生物化工分离技术；王安杏，王化杰，徐文斌，安徽职业技术学院(合肥 230011)；张敏，上海科源电子科技有限公司(上海 201101)。

中图分类号:R446.1

文献标识码：A

文章编号：1673-1794(2015)02-0047-04