锦鸡儿生物活性研究

王金梅,陈 龙,朱晓娣,连朋丽

(河南大学中药研究所,河南开封475004)

锦鸡儿生物活性研究

王金梅,陈 龙,朱晓娣,连朋丽

(河南大学中药研究所,河南开封475004)

摘 要:目的考察锦鸡儿生物活性。方法采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法对锦鸡儿体外总抗氧化活性进行评价,并同时测定了体外α-葡萄糖苷酶抑制活性和体外抗凝血活性。结果锦鸡儿具有一定的体外抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性和体外抗凝血活性,其中以乙酸乙酯部位抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性最强。结论锦鸡儿具有潜在的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性。

关键词:锦鸡儿;地上部分;抗氧化;体外α-葡萄糖苷酶抑制活性;体外抗凝血活性

锦鸡儿(Caragana sinica(Buchoz.)Rehd.)为豆科(Leguminesae)锦鸡儿属植物,常以根和花入药,其根又名金雀花根、白心皮等,民间常用于治疗虚损、劳热咳嗽、高血压、妇科疾患、关节炎等;花称金雀花,用于头晕头痛、耳鸣眼花、肺虚久咳、小儿疳积[1]。目前从锦鸡儿属植物中分离得到的化合物类型包括黄酮、二苯乙烯低聚体类、苯丙素、香豆素、萜类和甾体等;本属植物的药理活性主要集中在抗炎、镇痛、抗菌等[2]。国内外对锦鸡儿本植物的研究较少,据报道,从锦鸡儿的根中分离得到的化合物为二苯乙烯苷低聚体和异黄酮类化合物,生物活性主要集中在抗炎、提高免疫力及刺激成骨细胞增殖的活性[3],未见有对锦鸡儿地上部分的体外抗氧化活性、体外α-葡萄糖苷酶抑制活性、体外抗凝血活性的报道。为进一步开发锦鸡儿药用资源,我们对锦鸡儿地上部分进行了系统的生物活性研究。

1　仪器、材料与试剂

1.1仪器

电子天平(美国Mettler-Toledo公司);UV-2000型紫外可见分光光度计(美国Unico公司);Multiskan MK3酶标仪(美国thermo Electron公司);旋转蒸发仪(德国Heidolph公司);DELTA 320型p H计(美国Mettler-Toledo公司);CS-H1型混合器(北京博励阳科技公司);96微孔板;LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);TGL-16高速离心机(江苏金坛中大仪器厂);各种移液器及枪头等。

1.2材料

样品于2007年10月采集于贵州省黔南州地区,经黔南民族师范学院教授郭治友教授鉴定为豆科锦鸡儿属植物锦鸡儿(Caragana sinica)的地上部分,标本现存于河南大学中药研究所(No.20071015)。

1.3试剂

2,2'-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS,美国Fluka公司),二苯代苦味酰基自由基(DPPH,日本东京化成工业株式会社),6-羟基-2,5, 7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox,美国Aldrich公司),Fe3+-三吡啶三哑嗪(TPTZ,比利时Acros organics公司),丁基羟基茴香醚(BHA,比利时Acros organics公司),没食子酸丙酯(PG,比利时Acros organics公司),二丁基羟基甲苯(BHT,比利时Acros organics公司);α-葡萄糖苷酶(Sigma公司),对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma公司),阿卡波糖(Acarbose,Sigma公司),磷酸盐缓冲液(p H 6.8);獭兔(雄性、体重2.0～2.5 kg,由河南大学中药研究所提供(医动字09―1―2号),注射生理盐水(山东齐都药业有限公司),注射用灯盏花素(湖南恒生制药有限公司,20110202),维生素K1注射液(天津药业集团新郑股份有限公司,1109051);氯化钙溶液、枸橼酸钠溶液,甲醇,二甲基亚砜等为分析纯。

2　实验部分

2.1提取

取锦鸡儿地上部分9 kg,干燥后粉碎,加入体积分数10 L 70%甲醇溶液室温下冷浸3次,每次浸泡3 d。减压回收溶剂后,过滤除去沉淀,得到甲醇总浸膏300 g。该浸膏用1.5倍体积水分散,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,回收溶剂后,分别得到石油醚部位30 g,乙酸乙酯部位180 g,正丁醇部位75 g。

2.2抗氧化活性研究

2.2.1DPPH方法 参照文献[4],将样品和阳性对照品用甲醇配制成浓度为2,1,0.5,0.25,0.125, 0.062 5 g/L,取0.1 m L样品和阳性对照品加入3.5 m L DPPH甲醇溶液(0.06 mmol/L),混合30 min后测定515 nm处吸光度。每份样品和阳性对照品平行操作3次,取平均值,计算出清除率,并计算出半数抑制率IC50值。

2.2.2ABTS方法 按照文献[5],配制ABTS自由基工作液。将样品和阳性对照品用甲醇配制成浓度为2,1,0.5,0.25,0.125,0.062 5 g/L,取0.15 m L样品和阳性对照品加入2.85 m L ABTS自由基工作液,混合,放置10 min后,在734 nm处测定吸光度。每份样品和阳性对照品平行操作3次,取平均值,计算出清除率,并计算出半数抑制率IC50值。

2.2.3FRAP方法 按照文献[6]和文献[7],将样品用甲醇和阳性对照品配制成浓度为2,1,0.5,0.25, 0.125,0.062 5 g/L,取0.2 m L样品和阳性对照品加入3.8 m L新鲜配制的TPTZ工作液,混匀后37℃反应30 min后测定593 nm处吸光度,每份样品和阳性对照品平行操作3次。取平均值,计算出清除率,结果以Trolox当量表示。

2.3体外抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

参照文献[8],先进行酶活力测定,于405 nm波长下测OD值。同样的方法,加入8μL DMSO溶解的样品溶液,测定样品的OD值。实验共设5个组,每组三孔,分别为:①对照组(缓冲液+酶液+底物);②空白组对照组(缓冲液);③样品测定组(样品+酶液+底物);④样品对照组(样品+缓冲液);⑤阳性对照组(Acarbose+酶液+底物)。

按照酶活性抑制率%=(OD样品-OD样品空白)/(OD阴性-OD空白)×100%,用Origin软件绘制样品浓度与抑制率曲线,求出IC50值。

2.4体外凝血活性研究

家兔耳缘静脉取血3.6 m L,加至含400μL含枸橼酸钠溶液(38 g/L)的4m L离心管中,混匀, 1 000 r/min离心15 min,取上清液备用。取1.5 m L道夫管,样品组加入血浆0.1 m L及样品溶液各0.1 m L,阳性对照组加入血浆0.1 m L及药品溶液0.1 m L,空白组加入血浆0.1 m L及空白溶剂0.1 m L于37℃温育1 min后分别向每管加入2.775 g/L CaCl2溶液0.1 m L,计时,直到检测到纤维蛋白丝时停止计时,维生素K1、灯盏花素对照组重复3次,样品组重复6次,求算术平均值和标准差,即为血浆复钙时间。结果采用算术平均值和标准差表示,数值统计采用SPSS 17.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。

3　结果与讨论

3.1体外抗氧化

半数清除率(IC50)指清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度,根据不同浓度抗氧化剂的清除率作曲线求出。按照上述方法和步骤,对锦鸡儿地上部分的3种溶剂提取物的抗氧化活性进行研究,结果见表1。

由表1可以看出,锦鸡儿3个提取部位对DPPH自由基的清除能力均较低,说明其清除DPPH自由基的能力很差;在ABTS方法中,可以看出锦鸡儿乙酸乙酯部位对ABTS自由基清除能力最强(IC50: 7.11 g/L),强于阳性对照BHT,其次是锦鸡儿正丁醇部位,而石油醚部位无明显清除ABTS自由基的能力;在FRAP方法中,各提取物还原Fe3+能力顺序为锦鸡儿乙酸乙酯部位＞锦鸡儿正丁醇部位＞锦鸡儿石油醚部位,但差于阳性对照。由此可以看出,锦鸡儿有一定的抗氧化活性,其主要的抗氧化成分主要集中在其乙酸乙酯部位,为我们进一步追踪其系统分离其抗氧化活性成分提供了线索。

3.2体外抑制α-葡萄糖苷酶活性试验结果

按2.3方法,首次对锦鸡儿的不同提取部位进行体外α-葡萄糖苷酶抑制活性研究,结果见表2。

由表2可以看出,与阳性对照阿卡波糖相比,锦鸡儿各溶剂提取物均有较好的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中以锦鸡儿的乙酸乙酯部位活性最好,其次为石油醚部位。

3.3体外凝血活性研究

锦鸡儿石油醚部位、正丁醇部位对体外血浆复钙时间的影响结果,见表3。

由表3可以看出,与空白组对比,锦鸡儿石油醚部位和灯盏花素对体外凝血时间具有显著性差别(P＜0.001),而锦鸡儿石油醚部位和灯盏花素体外凝血时间无显著性差别(P＞0.05),表明锦鸡儿石油醚部位有较好的体外抗凝血作用;与空白组相比、锦鸡儿正丁醇部位和维生素K1组对体外促凝血时间有显著性差别,而正丁醇部位体外止血时间远远小于维生素K1(P＜0.001),表示锦鸡儿正丁醇部位促凝血作用明显。

4　结论

我们首次对锦鸡儿干燥地上部分的不同溶剂提取物进行了采体外抗氧化、体外抑制α-葡萄糖苷酶活性和凝血活性的考察,结果表明:锦鸡儿具有一定的抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、抗凝血和促凝血的作用,其中其乙酸乙酯部位的抗氧化活性和体外抑制α-葡萄糖苷酶活性最强。这一结果对于指导我们对锦鸡儿乙酸乙酯部位进行系统的化学分离有重要的意义,并对锦鸡儿资源的进一步开发提供了一定的理论支撑。

参考文献:

[1]Wu ZM.platform for new Chinese Herbal Materia Medica (Second)[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Publishing House,1991:109.

[2]Chen L,Zhang YB,Wang JJ,et al.The progress on the chemical constitutions and pharmacological activities of Caragana.China Medi pharm,2012,2(18):9―11.

[3]Wang SG.Studies on the Chemical Constituents and Quality Standard of Caragana sinica[D].Ph.D.Thesis of School of Pharmacy Fudan University,Shanghai:2004:(7―34).

[4]Liu JK,Hu L,Dong ZJ,et al.DPPH radical scavenging activity of ten natural p-terphenyl derivatives obtained from three edible mushrooms indigenous to China[J]. Chem Biodiver,2004,1(2):601―605.

[5]Kang WY,Li CF,Song YL.Antioxidant xanthones from Securidaca inappendiculata.Chin J Chin Mater Med,2008, 33(12):1 982―1 985.

[6]Li CF,Song YL,Liu YX,et al.Antioxidant activity of extracts from Lysimachia Clethroide.Fine Chem,2008, 25(10):1 193―1 195.

[7]Benzie I,Strain JJ.The ferric reducing ability of plasmaasa measure of“antioxidant power”:the FRAP assay [J].Anal Biochem,1996,239(1):70―76.

[8]Tian PY,Kang WY.Studies onα-glucosidase inhibitory activities of Aeschynanthus maculatus[J].Chin J Chin-Mater Med,2012,37(19):2 910.

[责任编辑 段金卯]

Studies on biological activities of Caragana sinica

WANG Jinmei，CHEN Long，ZHU Xiaodi，LIAN Pengli
（Institute of Chinese Material Medicine，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Abstract：ObjectiveTo study the biological activities of Caragana sinica.MethodsThe total antioxidant activity of Caragana sinica was evaluated by three methods:DPPH radical scavenging，ABTS radical scavenging and FRAP assay，α-glucosidase inhibitory activity and anticoagulant activity in vitro were also studied.ResultsThe results showed that the ethyl acetate extract of Caragana sinica has the highest antioxidant activity andα-glucosidase inhibitory activity.ConclusionCaragana sinica has antioxidant activity andα-glucosidase inhibitory activity.

Key words：Caragana sinica；aerial part；antioxidant activity；α-glucosidase inhibitory activity；anticoagulant activity in vitro

作者简介:王金梅(1983―),女,硕士,讲师,从事天然药物活性成分研究工作。

基金项目:河南省教育厅科学技术研究重点项目(13B360913)。

收稿日期:2015-03-12

中图分类号:R285.5

文献标识码:A

文章编号:1672―7606(2015)02―0091―03