SIRT7基因乙酰化活性缺失突变真核表达载体的构建

2015-03-17李小娜梁慧敏王天晓刘文斌郑立娟刘晋祎时小燕

河南大学学报（医学版） 2015年2期

李小娜,梁慧敏,王天晓,韩飞,刘文斌,郑立娟,董严,刘晋祎,时小燕*

(1.河南大学中药研究所,河南开封475004;2.河南大学淮河医院,河南开封475000;3.第三军医大学军事预防医学院军事毒理学研究所,重庆400038;4.甘肃省人民医院,甘肃兰州730000)

李小娜1,3,梁慧敏2,王天晓1,韩飞3,刘文斌3,郑立娟4,董严3,刘晋祎3,时小燕1,3*

摘要:目的构建SIRT7基因乙酰化活性缺失的定点突变真核表达载体。方法用RT-PCR法从293T细胞中扩增SIRT7基因,并克隆到真核载体pcDNA 3.1/myc-His(―)A上。采用Two-step PCR定点突变技术,构建SIRT7基因的H187Y突变质粒,经测序确证定点突变成功,再将SIRT7及突变载体转染293T细胞,Western blot检测融合蛋白表达。结果克隆出SIRT7基因,构建了真核载体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7,经Two-step PCR获得突变体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y。DNA测序结果表明,编码187位氨基酸的560～562位碱基由CAC突变为TAC,其他碱基均无突变。SIRT7和H187Y突变载体转染293T细胞后,可检测出myc-SIRT7融合蛋白表达。结论成功构建了SIRT7以及H187Y突变的真核表达载体。

关键词:SIRT7;Two-step PCR;定点突变;真核表达载体

Sirtuins为哺乳动物第Ⅲ类组蛋白去乙酰基酶家族,共包括7个成员SIRT1-SIRT7。Sirtuins成员在细胞凋亡、DNA损伤修复及基因沉默等方面发挥重要作用[1-2]。目前,关于SIRT7的生物学功能研究较少。与该家族中其他成员相似,它亦具有NAD+依赖的去乙酰化酶活性,并且其生物学功能的发挥也主要是通过其去乙酰化酶活性来实现的。SIRT7基因为一单拷贝基因,由10个外显子组成,在基因组上定位于17q25.3。SIRT7与异染色体区和核仁相结合,主要定位于核仁,少部分存在于胞浆和线粒体[3-4]。SIRT7可能参与调控RNA转录、细胞周期以及肿瘤发生。由于SIRT7自身复杂性和对细胞环境依赖性,关于SIRT7生物学功能目前存在争论[5-7]。生物信息学分析表明,SIRT7基因内高度保守的NAD+依赖的催化中心区域位于第107～278氨基酸残基之间。有文献报道,SIRT7第187位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)后,其去乙酰化酶活性降低。结合上述生物信息学分析及已有的研究,为更好地深入研究SIRT7的功能,我们首先克隆出SIRT7基因并利用Two-step PCR构建了SIRT7 H187Y位点突变基因的真核表达载体,用以进一步研究SIRT7的生物学功能。

1　材料与方法

1.1主要试剂和材料

M-MLV逆转录酶、RNasin、Oligo(d T)15、Trizol试剂和脂质体转染试剂盒(美国Invitrogene公司产品);限制性内切酶XhoI、EcoRI、T4 DNA连接酶(NEB公司产品);2×Pfu Master Mix、DNA凝胶回收试剂盒(北京康为世纪生物公司产品);PCR产物纯化试剂盒和质粒纯化试剂盒(美国promega公司产品);myc小鼠单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技术有限公司产品);Easy-See Western Blot检测试剂盒(北京全式金生物技术有限公司);大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生化科技北京公司);PCR引物合成及测序由上海英骏公司完成;真核载体pcDNA 3.1/myc-His(―)A为北京军事医学科学院3所1室钱露博士惠赠;293T细胞购自中科院上海细胞库物保藏中心。

1.2人SIRT7基因全长的克隆

用Trizol试剂从培养人293T细胞中提取总RNA,逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链。根据GenBank中提供的SIRT7序列(NM_ 016538.2),用Primer Premier 6.0软件设计扩增SIRT7全长基因的上游引物: F:5’-AGACTCGAGCGATGGCAGCCGGGGGTCT GA-3’,引入酶切位点XhoI(下划线部分);下游引物R:5’-GTGGAATTCTCGTCACTTTCTTCCTTTT TGTGCGT-3’,引入酶切位点Eco RI(下划线部分)。

以cDNA第一链为模板,用上述特异引物进行PCR扩增。循环参数为:95℃,5 min,95℃,45 s, 53℃,1 min,72℃,1 min,共30个循环。PCR产物纯化后与pcDNA 3.1/myc-His(―)A载体分别用XhoI和EcoRI双酶切并纯化,T4DNA连接酶连接后转化DH5α菌。在含氨苄青霉素的LB平板上培养后挑取单菌落,摇菌后提质粒,进行双酶切鉴定,酶切正确的阳性重组质粒送上海英骏公司测序。序列正确者记为pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7。

1.3两步法PCR定点突变

PCR扩增突变片段:合成4条引物,其中2条(F,R)位于两端,用于扩增SIRT7全长片段,另外2条(M1,M2)含有突变位点并且部分序列互补。引物序列如下:

F:5’-AGACTCGAGCGATGGCAGCCGGGGGTCT GA-3’,引入酶切位点XhoI(下划线部分);R:5’-GTGGAATTCTCGTCACTTTCTTCCTTTTTGT GCGT-3’,引入酶切位点Eco RI(下划线部分)。M1:5’-CATCTCCGAGCTCTACGGGAACATGTACAT-3’,(下划线为突变位点T);M2:5’-ATG TACATGTTCCCGTAGAGCTCGGAGATG-3’(下划线为突变位点A)。

各引物在PCR扩增片段上的位置,见图1。

以正常重组质粒pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7为模板,分别F/M2和M1/R为引物进行PCR扩增,切胶回收两个片段。再以F/R为引物,将以上两个片段的纯化物同时加入作为模板,进行PCR扩增。将得到的片段纯化后与pcDNA 3.1/myc-His(―)A载体分别用XhoI和Eco RI双酶切并纯化,T4DNA连接酶连接后转化DH5α菌。在含氨苄青霉素的LB平板上培养后挑取单菌落,摇菌后提质粒,进行双酶切鉴定,酶切正确的阳性重组质粒送上海英骏公司测序。序列正确者记为pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7 H 187Y。

2　结果

2.1人SIRT7基因全长的克隆

以293T细胞的总RNA为模板,经RT-PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳后显示出一条约1 203 bp大小的DNA片段,见图2。PCR产物经胶回收后,成功克隆至pc DNA 3.1/myc-His载体。重组质粒经XhoI和EcoRI双酶切得到约5 500 bp和1 203 bp的片段,与预期结果一致,见图3。测序结果显示,插入片段长度为1 203 bp,与NCBI已公布的人类SIRT7核酸序列(NM-016538.2)一致。

2.2两步法PCR定点突变结果

引物M1和M2携带突变位点,并且部分重叠互补。分别以F/M2和M1/R为引物,重组质粒pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7为模板,扩增出的两个突变片段,由于中间有一段序列互补,故可以在PCR退火过程中配对连接形成长的片段。再以此长片段为模板,F/R为引物PCR时,得到1 203bp片段,见图4。通过酶切与连接将该突变片段插入到pcDNA 3.1/ myc-His载体中,经XhoI和EcoRI双酶切筛选出阳性克隆pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y,见图5。测序结果证实,已将突变点引入,第559位密码子由CAC突变为TAC,其他碱基均未发生改变。部分测序结果,见图6。

3　讨论

SIRT7作为第Ⅲ类组蛋白去乙酰基酶家族成员之一,目前,对其生物学功能研究较少。少量研究[8-9]提示,SIRT7可能参与调控RNA转录、细胞周期以及肿瘤发生。由于SIRT7基因本身功能的复杂性, SIRT7在肿瘤形成过程中充当癌基因还是抑癌基因,目前尚无定论。

有报道发现,SIRT7蛋白催化中心区域内的H187Y突变,将导致其NAD+依赖的去乙酰化酶活性降低,进而影响SRIT7的生物学功能。鉴于此,我们为深入探讨SIRT7基因的生物学功能,本研究首先从293T细胞中成功克隆出SIRT7基因,并利用Two-step PCR定点突变技术构建了含SIRT7H187Y突变体真核表达载体。

我们首先设计了含突变位点碱基的引物,通过两步法PCR,使两个重叠片段可在随后的延伸反应中融合,然后利用全长引物通过PCR将SIRT7 H187Y突变体全长扩增出来。突变产物序列分析结果表明,目的基因引入了预期位点的突变,而其他位点碱基无一发生突变。总之,本研究成功克隆得到SIRT7基因全长编码序列及其H187Y突变体,为进一步研究SIRT7基因的生物学功能奠定了基础。

参考文献:

[1]Blander G,Guarente L.The Sir2 family of protein deacetylases [J].Annu Rev Biochem,2004,73:417―435.

[2]Fu M,Liu M,Sauve A A,et al.Hormonal control of androgen receptor function through SIRT1[J].Mol Cell Biol,2006,26(21):8 122―8 135.

[3]Voelter-Mahlknecht S,Letzel S,Mahlknecht U.Fluorescence in situ hybridization and chromosomal organization of the human Sirtuin 7 gene[J].Int J Oncol.2006,28 (4):899―908.

[4]Yamamoto H,Schoonjans K,Auwerx J.Sirtuin functions in health and disease[J].Mol Endocrinol,2007,21(8): 1 745―1 755.

[5]Voelter-Mahlknecht S,Letzel S,Mahlknecht U.Fluorescence in situ hybridization and chromosomal organization of the human Sirtuin 7 gene[J].Int J Oncol,2006,28 (4):899―908.

[6]Nigris F,Cerutti J,Morelli C,et al.Isolation of a SIR-like gene,SIR-T8,that is overexpressed in thyroid carcinoma cell lines and tissues[J].Br J Cancer.2002,86(6): 917―923.

[7]Frye R."SIRT8"expressed in thyroid cancer is actually SIRT7[J].Br J Cancer,2002,87(12):1 479.

[8]Ford E,Voit R,Liszt G,et al.Mammalian Sir2 homolog SIRT7 is an activator of RNA polymerase I transcription [J].Genes Dev,2006,20(9):1 075―1 080.

[9]Ashraf N,Zino S,Macintyre A,et al.Altered sirtuin expression is associated with node-positive breast cancer[J]. Br J Cancer,2006,95(8):1 056―1 061.

[责任编辑时红]

The construction of eukaryotic expression vectors for SIRT7 gene with acetylation activity deletion

LI Xiaona1，3，LIANG Huimin2，WANG Tianxiao1，HAN Fei3，LIU Wenbin3，ZHENG Lijuan4，DONG Yan3，LIU Jinyi3，SHI Xiaoyan1，3＊
（1.Institute of Chinese material medicine，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Huaihe Clinical College of Henan University，Kaifeng.Henan 475000，China；3.Institute of Toxicology，College of Preventive Medicine，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；4.Gansu province people hospital，Lanzhou，Gansu 730000，China）

Abstract：ObjectiveTo construct eukaryotic expression vectors for SIRT7 gene with acetylation activity deletion induced by site directed mutagenesis.MethodsSIRT7 gene was amplified by RT-PCR from 293T cells and cloned into the eukaryotic vector pcDNA 3.1/myc-His（-）A.Site directed mutagenesis method based on two-step PCR was performed to construct dominant negative（DN）mutants H187Y.The point mutation was verified by DNA sequencing.The mammalian 293T cell was transfected with SIRT7 and the mutants.The expression of the fused proteins was determined by Western blot.ResultsSIRT7 gene was cloned and the eukaryotic vector pcDNA 3.1/ myc-His-SIRT7 was constructed.The mutants were obtained by two-step PCR.DNA sequencing showed that CAC at 560―562 bps sites，which encoded the 187 amino acids，was changed to TAC.No mutation was found in other base pair sites of the recombinant plasmids.The fusion protein myc-SIRT7 was detectable by Western blot in 293T cells transfected with the mutant vectors.ConclusionThe eukaryotic expression vectors for SIRT7 and its mutantsbook=12,ebook=17H187Y were successfully constructed.

Key words：SIRT7；Two-step PCR；site directed mutagenesis；eukaryotic expression vector

*通讯作者:时小燕(1975―),女,河南灵宝人,博士,副教授,从事肿瘤分子机制的研究工作。

基金项目:中国博士后科学基金(2013M542496);河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A310094)。

作者简介:李小娜(1987―),女,河南安阳人,硕士研究生,从事肿瘤分子机制的研究工作。

收稿日期:2015-02-12

中图分类号:R730.2

文献标识码:A

文章编号:1672―7606(2015)02―0087―04

河南大学学报（医学版）

2015年2期