高密度组织芯片简易制作方法及体会

2015-03-17赵静,徐明堂,赵焕芬等

河北医科大学学报 2015年9期

·论著·

高密度组织芯片简易制作方法及体会

赵静1，徐明堂2，赵焕芬2，宋光耀3*

(1.河北省人民医院肿瘤一科，河北石家庄 050051；2.河北省人民医院病理科，河北石家庄 050051；3.河北省人民医院内分泌科，河北石家庄 050051)

[摘要]目的介绍高密度组织芯片的简易制作技术。方法使用内径1.8 mm的自制套针，手工制成组织芯蜡块及组织芯片，并进行 HE染色、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测。结果制备组织芯片蜡块2个，为9×12点阵的乳腺癌组织芯蜡块， 9×10点阵的结肠癌及胃癌混合组织芯蜡块。蜡块内无空泡及裂痕，组织芯阵列整齐，无组织芯移位或倒浮。切片数十张，经HE染色后观察，芯片上微阵列整齐分界清楚，无微组织片皱褶及脱片现象。经IHC及FISH技术检测，与常规病理切片检测进行对照观察，结果准确一致。结论组织芯片技术具有大样本、高通量、高效率、低消耗、易于标准化等诸多优点，本研究所述制备技术简单易掌控，有利于组织芯片技术在临床和科研中普及并推广。

[关键词]乳腺肿瘤；胃肿瘤；组织芯片；诊断技术和方法doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.09.030

[收稿日期]2014-06-04；[修回日期]2014-07-28

[作者简介]赵静(1981-)，女，河北石家庄人，河北省人民医院主治医师，医学博士研究生，从事肿瘤的靶向治疗。

通讯作者*。E-mail: sguangyao2@163.com

[中图分类号]R737.9；R735.2[文献标志码]B

随着肿瘤生物学的迅猛发展，大量基因及蛋白逐渐被发现参与肿瘤的发生发展。为了评价新检测到的潜在癌基因和靶蛋白的临床意义，通常需要检测大量的肿瘤样本。用传统的分子病理学方法制作样本，耗时耗力，而且消耗试剂及宝贵的组织资源，亟需高通量技术方法解决。组织芯片也称组织微阵列(tissue microarray,TMA)，是将数十个甚至上千个组织标本规则有序地排布于一张载玻片上，进行同一指标检测的原位组织学研究技术[1]。组织芯片具有小体积、大样本、高通量、高效率、低消耗等诸多优势，可以同时对大量组织样本进行研究分析，简便经济。在疾病的分子诊断、预测预后指标的筛查、诊断治疗靶点的验证和定位等领域发挥了愈来愈重要的作用，该技术有利于将新发现的分子标记或靶点快速转化为临床应用，将成为转化性研究的重要方法及桥梁[2-3]。但是，由于组织芯片的制作设备昂贵，基层医院甚至很多大型医院都无法顺利开展此项技术。我们经过长期的实践改良，逐渐掌握了一套较高水平并且经济实用的高密度组织芯片制作技术，现以乳腺癌及胃癌和结肠癌的组织芯片制作为例，将方法及体会介绍如下。

1材料与方法

1.1标本来源选择2009年4月—2013年12月河北省人民医院乳腺癌手术切除的病理标本65例，癌旁正常乳腺组织37例。2010年1月—2013年12月胃癌手术切除的病理标本28例，癌旁正常胃组织12例；结肠癌手术切除的病理标本32例，癌旁正常结肠组织12例。所有标本均经常规石蜡包埋切片以及组织病理学检查证实。石蜡采用国产的熔点为52～56 ℃医用石蜡。

1.2仪器设备组织包埋仪(Thermo Shandon Histocentre 3)，轮转切片机(德国徕卡仪器公司 RM2245)，一次性石蜡切片刀(德国莱卡公司)，防脱载玻片，组织芯穿刺针(由肾穿针改制，直径1.8 mm)，包埋模，胶水(胶水与蒸馏水1∶1混合)，小刀，镊子。

1.3方法

1.3.1组织芯蜡模制备应用组织包埋仪向不锈钢包埋模中直接注入蜡液至与模周水平，冷却至蜡凝固。根据组织样本量的大小，用小刀在蜡模上挖取所需大小的组织芯槽，槽深到包埋模底。本研究制作了15 mm×15 mm及15 mm×20 mm 2个芯槽。注意槽边缘要比蜡模边缘小3～5 mm，槽四壁要光滑并垂直于模底，以防组织芯附着不稳。制作工具见图1。

1.3.2组织芯选取及蜡块制备 ①定位：首先选取所研究病例的HE染色切片及其对应的蜡块，由经验丰富的病理科医师进行切片筛选，在显微镜下找到病变区，用记号笔作标记，注意标记范围尽量小，直径小于3 mm，并选取富含肿瘤细胞的区域，尽量避免因标记区域过大而取不到理想的病变组织。在灯光透照下反复比对切片标记点对应的石蜡包埋块上的相应位置，并同样在蜡块上做好标记。注意尽量选取蜡块中病变组织较厚的地方标记取材，以提高制备的组织芯蜡块的利用率。②取芯：用自制的穿刺针垂直插入标记点处的组织，轻轻旋转穿刺针取出组织芯。③固定：用镊子小心地夹取组织芯柱，使有病变组织的一端向下沾取少许胶水，紧贴芯槽壁粘贴到槽底。其他组织芯柱依次与前一个组织芯紧密相贴，组织芯排与排之间也是直接粘贴，直至制作完毕。注意动作轻柔并使芯柱之间紧密相连以免芯柱倾倒，因组织芯长短不一，在放置组织芯时轻压芯柱，使其在槽底处于同一切面水平。室温过夜或42 ℃放置数小时，使黏附组织芯的胶水干燥。④包埋：应用组织包埋仪向包埋模的芯槽中直接注入蜡液填满未布组织芯的区域，并立即把包埋模置于包埋仪的热台上(65 ℃)，直到蜡模与组织芯柱自身的石蜡全部熔解,组织芯阵列中的微组织块在蜡液中全部触底并清晰地呈现。小心平稳地将芯柱溶解状态的包埋模移至冷台，底层蜡液迅速凝固，组织芯列阵也随之固定，随后经包埋仪加注新的蜡液，并放上塑料包埋盒，继续放置冷台冷却，待石蜡完全凝固后从包埋模中取出，既得组织芯阵列石蜡包埋块。

1.3.3组织芯片的制作切片前将组织芯蜡块放到冷台上充分冷却，切片时，修平切面，待组织芯充分暴露后，连续切厚4 μm切片，直到出现不满意的切片。展片时，用二次展片法。初展直接用室温水展片，再展片用温水,但水温要比常规展片温度低，48～50 ℃较适宜，展片温度过高不易控制展片时间，组织芯片上的微组织易发生离散，温度过低则难以保证其充分展开。载玻片用3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷处理的防脱片，裱片后用吸水纸小心地吸净组织芯蜡片与载玻片之间的水分，否则烤片时阵列中微组织易发生移位。随后65 ℃烤片4～6 h，以保证组织牢固地黏附于载玻片上，取出切片自然降至室温。芯片制作完成后如长期不用可封蜡后保存于4 ℃冰箱中。

2结果

2.1组织芯蜡块按上述方法制备组织芯片蜡块2个，一个为9×12点阵的乳腺癌组织芯蜡块，另一个为9×10点阵的结肠癌及胃癌混合组织芯蜡块。蜡块内无空泡，无裂痕，组织芯阵列整齐，无变形；无组织芯移位、错位或倒浮现象；包埋块中组织芯切面基本在一个平面上，没有明显凹凸不平现象。

2.2组织芯片一个组织芯片蜡块大约可切出满意切片(厚4 μm左右)50～100张。切片大体和镜下观察，组织芯片上微阵列整齐、彼此分界清楚，无微组织片皱褶及脱片现象。组织芯片经HE染色、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测后，经病理诊断医师阅片，并与相对应的常规病理切片染色片进行对照观察，病理诊断准确一致(图2)。

3讨论

组织芯片技术是生物芯片技术的一个重要分支。组织芯片将众多样本放在同一载玻片上，可以同时对这些样本的DNA、RNA、蛋白质水平进行检测，同化了实验条件，减少了常规方法中因分批、分次实验造成的误差，并节约了实验试剂和时间[4]。几乎任何组织都能够使用TMA技术排列，所以其应用范围相当广泛。目前TMA技术绝大多数应用于癌症研究领域，如多肿瘤组织芯片(不同类型肿瘤)、肿瘤进展组织芯片(有肿瘤分期资料)、肿瘤预后组织芯片(有随访至临床终点的资料)等[5-6]。TMA被还成功地用于许多非肿瘤疾病，如阿尔茨海默症或炎症性疾病的研究[7]。组织芯片的应用领域也在不断的拓展，可用于IHC及原位杂交等分子生物学技术研究[8-9]。TMA为基因功能研究走向临床提供了捷径。

由于组织芯片制作仪价格昂贵，使该项技术无法在绝大多数医院开展。亦有报道手工制作组织芯片的技术，但绝大多数只适合50个以下微阵列的芯片制作。本研究介绍的简易组织芯片制作技术成本低，简便快捷，可操作性强，经过长期反复实践摸索改良，现已成熟并且能制作高质量高密度的组织芯片，微阵列达90～100个甚至更多，满足了临床及科研的需要，并且容易在基层医院开展。传统的制作组织芯片的方法都是先在模体蜡块上穿刺出多个组织芯的孔位，然后植入组织芯[10]。这种方法制作繁琐不易控制，芯片密度小，对蜡质的要求较高，对试剂的需求量大。而改良后我们直接在受体蜡块上挖一芯槽，手工操作更容易，组织芯用少许胶水粘连相互紧贴直接排布于槽内，芯片密度更大，15 mm×15 mm的芯槽内可包埋直径1.8 mm的组织芯柱90个。芯柱之间相互紧贴排布，可使芯柱间无多余空隙，互相支撑避免倾倒移位，胶水固定使得在制作过程中芯柱更加稳固。制作过程中需要注意几点：①组织芯柱粘取胶水时，一定要让有病变组织的一端向下粘胶，并植入芯槽内，这样能使病变组织处于同一平面内；②组织芯阵列排列完毕，不要立即熔蜡包埋，应放入烤箱使胶水挥发干燥，否则芯柱固定不牢靠影响包埋和切片；③在熔蜡阶段，切勿移动包埋模，即使发现芯柱移位或倾倒也不能用镊子或其他工具试图触碰芯柱，否则会造成更多的组织芯移位倒浮，打乱阵列排布；④裱片时，尽量用吸水纸吸净蜡片与载玻片之间的水分，否则在烤片时，石蜡熔化，微组织片可能随着水分的流出而游走；⑤在切片之前最好将蜡块放置4 ℃冰箱中过夜，连续切片之前再放置冰台上片刻，可以使组织收缩利于切片；⑥展片的水温控制在48 ℃左右，展片3、4 s迅速捞片，展片温度过高或时间延长会使微组织离散；⑦组织芯蜡块包埋的材料可稳定多年，蜡块切片后需封蜡保存，大批量制备组织芯片时，切片后的组织可能由于氧化丢失某些抗原，最好是芯片染色前即切即用，如果一次将组织芯蜡块全部切完，应将组织芯片蜡封低温保存。

组织芯片也有其潜在的缺点，最主要的是组织取材相对较少，而蛋白质的表达在肿瘤内部具有异质性，所取位点的微组织并不一定能代表肿瘤的全貌；Fonseca等[11]利用82例多形性腺瘤标本，分别制作了直径为1.0、2.0和3.0 mm组织芯的TMA，IHC分析细胞角蛋白7、Ki67、P63及CD34，结果显示与传统大标本病理切片相比，1.0 mm芯的TMA阳性率低于2.0和3.0 mm组织芯TMA，原因可能与基质组织的量增加有关，推荐直径2.0 mm的TMA为最佳选择。van Zwieten[12]利用57种抗体，对含有89个直径1 mm组织芯的TMA进行研究，以评估TMA技术对IHC诊断的有效性和可行性，结果显示，相对于普通蜡块切片染色，应用TMA技术的55种抗体得到预期的阳性染色，一些抗体还出现了未预料的阳性免疫反应，认为TMA技术可以有效地进行IHC诊断，并为组织病理学家提供有价值的信息。因此，增大组织芯直径和增加同一样本组织芯的数量可以很好地解决异质性的问题。推荐组织芯直径最好在1.0～2.0 mm；研究病例较少，若组织芯直径小于1.0 mm，建议每个病例最好选取2个点位。Avninder等[13]提出在制作TMA时，有些组织需要特别注意，如前列腺癌建议多位点取芯，骨组织取芯困难，对于骨病变如骨肉瘤最好采用直径1.0 mm的针芯取材。其次切片上微组织在加工过程中的移位、脱落，给结果的判定带来误差，为了减少这种误差，我们通过使用黏合剂(稀释了的胶水)来固定组织芯，达到了很好的效果。

组织芯片技术具有大样本、高通量、高效率、低消耗、易于标准化等诸多优点，还可以与IHC、原位杂交、原位PCR等其他分子生物学技术相结合。加之本文介绍的自制工具及操作技术简便易行，经济实用，易于普及，尤其适用于基层医院。因此，组织芯片技术将成为筛查与诊断、预后和预测相关的生物标志物的快速及高性价比的方式，并逐渐成为个体化医疗中发现并验证生物标记的必备工具。采用组织芯片将大大加快基础研究成果向临床应用的转化。(本文图见封三)

[参考文献]

[1]Kallioniemi OP,Wagner U,Kononen J,et al.Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer[J].Hum Mol Genet,2001,10(7):657-662.

[2]Pandey A,Kurup A,Shrivastava A,et al.Cancer testes antigens in breast cancer:biological role,regulation,and therapeutic applicability[J].Int Rev Immunol,2012,31(5):302-320.

[3]Hawley S,Fazli L,McKenney JK,et al.A model for the design and construction of a resource for the validation of prognostic prostate cancer biomarkers:the Canary Prostate Cancer Tissue Microarray[J].Adv Anat Pathol,2013,20(1):39-44.

[4]Jawhar NM.Tissue microarray:a rapidly evolving diagnostic and research tool[J].Ann Saudi Med,2009,29(2):123-127.

[5]Arafa M,Boniver J,Delvenne P.Progression model tissue microarray (TMA) for the study of uterine carcinomas[J].Dis Markers,2010,28(5):267-272.

[6]Sun X,Guo L,Wang J,et al.Prognostic value of matrix metalloproteinase 9 expression in patients with juvenile nasopharyngeal angiofibroma:Tissue microarray analysis[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2014,78(8):1232-1238.

[7]Simon R.Applications of tissue microarray technology[J].Methods Mol Biol,2010,664:1-16.

[8]Franco R,Caraglia M,Facchini G,et al.The role of tissue microarray in the era of target-based agents[J].Expert Rev Anticancer Ther,2011,11(6):859-869.

[9]Cihoric N,Savic S,Schneider S,et al.Prognostic role of FGFR1 amplification in early-stage non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer,2014,110(12):2914-2922.

[10]何春年,赵焕芬,陈士超,等.HBME-1和p14ARF抑癌基因在甲状腺肿瘤诊断与鉴别中的意义[J].河北医科大学学报,2008,29(1):50-53.

[11]Fonseca FP,de Andrade BA,Rangel AL,et al.Tissue microarray is a reliable method for immunohistochemical analysis of pleomorphic adenoma[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol,2014,117(1):81-88.

[12]van Zwieten A.Tissue microarray technology and findings for diagnostic immunohistochemistry[J].Pathology,2013,45(1):71-79.

[13]Avninder S,Ylaya K,Hewitt SM.Tissue microarray:a simple technology that has revolutionized research in pathology[J].J Postgrad Med,2008,54(2):158-162. OP,Wagner U,Kononen J,et al.Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer[J].Hum Mol Genet,2001,10(7):657-662.