兔声带注射脱细胞真皮基质和自体脂肪的实验研究

郝媛媛孙建军，2

·实验研究·

兔声带注射脱细胞真皮基质和自体脂肪的实验研究

郝媛媛1孙建军1，2

目的 探讨自体脂肪和脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）声带填充的临床应用价值。方法 16只新西兰兔建立单侧声带麻痹模型后，随机分为脂肪组（麻痹侧声带注射自体脂肪）和ADM组（麻痹侧声带注射ADM），每组8只。每组动物于声带注射术后2、4、8和12周各取2只行纤维喉镜检查观察声带形态变化后，处死动物并取出全喉，沿喉轴位自室带至声门下连续切片，进行HE染色，高倍光学显微镜下观察填充材料组织学改变，并使用autoCAD软件进行填充材料剩余体积估算。结果 两组的声带填充材料剩余体积均随时间逐渐缩小，缩小的速度差异无统计学意义（P＞0.05）。脂肪组自体脂肪注射术后2周可见成活的脂肪细胞呈团块状分布，与周围组织未形成较明显分界，后成活的脂肪细胞逐渐减少，代之以纤维结缔组织相连的多个大泡，四周存活少量的脂肪细胞；术后3月脂肪团块周围被纤维结缔组织包绕，形成明显的包膜。ADM组术后2周微粒间可见成纤维细胞长入及新生血管形成，随后成纤维细胞逐渐增多，术后3月植入的ADM团块仍可见基本轮廓，组织结构较致密，但与周围组织界限不明显。结论 兔声带注射自体脂肪和ADM后的吸收速率无显著差异，但ADM植入后组织相容性好，可逐渐被原有组织改建、替代，作为声带注射填充材料有较大的发展空间和临床应用价值。

声带麻痹； 声带注射； 自体脂肪； 脱细胞真皮基质

声带填充注射喉成形术（injection laryngoplasty，IL）是临床常用于治疗声带萎缩、声带麻痹、声带瘢痕、声带沟以及环杓关节固定等疾病所致声门闭合不全的有效手段之一，其原理系将自体组织材料、同种异体材料或人工生物材料通过局部注射方式，填充到声带组织不同层次或声带旁间隙，依其容积效应纠正声门闭合不全，不同程度复原声带振动特性，改善发声功能［1］。近年来生物材料的发展与优化为临床提供了更多的选择，然而不同材料在组织重塑效果、作用持续时间、声带振动特性以及安全性和并发症等方面的差异使得不同材料作为声带填充物的选择仍然存在争议。

目前常用的声带填充材料中，自体脂肪组织作为一种安全、有效的材料在临床得到了广泛应用；而根据国外文献报道，脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）用于声带注射已有十余年历史，其材料来源、使用效果、安全性与稳定性受到了肯定［2］，然而，对于自体脂肪和ADM的比较研究却鲜有报道。为此，本研究拟通过建立喉返神经损伤致声带麻痹动物模型，观察自体脂肪、ADM微粒植入声带后的存留时间、重塑特性及组织学改变，探讨这两种材料用于声带注射填充的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选择健康成年新西兰兔16只，雌雄不限，体重2.0～3.0 kg。实验前均经纤维喉镜检查，确定其声带形态及运动正常。16只实验动物随机分为脂肪组（麻痹侧声带注射自体脂肪）和ADM组（麻痹侧声带注射ADM），每组8只。

1.2 声带麻痹动物模型制备 将速眠新Ⅱ号注射液和氯胺酮注射液1：1混合后，对两组动物行肌肉注射麻醉（0.35～0.45 ml／kg）。动物麻醉固定后术区备皮、消毒，取颈部正中纵行切口，暴露甲状腺，翻开甲状腺左叶，找到左侧甲状腺下动脉原伴行于该血管的喉返神经，切除1 cm喉返神经，断端局部筋膜包埋，缝合切口［3］。术后立即使用纤维喉镜检查，以左侧声带随呼吸节律无活动、声带缩短呈弓形即为造模成功（图1），观察2周后进行后续实验。

1.3 声带注射材料的制备及注射方法

1.3.1 自体脂肪制备 左侧声带麻痹造模成功2周后，脂肪组动物麻醉后，取腹部纵行切口，依次分离皮下、肌肉组织，打开腹腔，切取2 cm×2 cm× 0.5 cm大网膜脂肪组织，将血管去除，置于生理盐水中漂洗，然后用剪刀剪碎，将细颗粒糊状的脂肪组织1 ml放入1 ml注射器中备用。

1.3.2 ADM注射材料制备 将同种异体脱细胞真皮基质补片（由北京清源伟业生物组织工程科技有限公司提供）用物理方法切割成约100μm×100 μm×100μm微粒，每100 mg分装入5 ml注射器内，Co60辐照灭菌。将微粒状ADM与溶媒（0.5%普鲁卡因）按0.1 g：0.8 ml制备，放入1 ml注射器中备用。

1.3.3 声带注射填充方法 两组动物全身麻醉固定后，术区消毒，颈部纵行切开，暴露甲状软骨，紧贴甲状软骨下缘中点向左2～5 mm处，斜上方向进针，将针头刺入声门旁间隙，同时，经口插入纤维喉镜，直视下移动针头并置于声带突尖端的外侧注射0.15 ml自体脂肪或ADM［4］。注射完毕动物常规复苏后正常饲养，观察动物进食、呼吸等情况。

1.4 声带形态观察 两组动物于声带注射填充术后第2、4、8、12周各取2只进行纤维喉镜检查，观察注射侧声带的形态及运动。

1.5 光镜下观察及填充物体积评估 各组在上述各时间点完成纤维喉镜检查后，分别处死该2只动物，取出全喉，置于10%福尔马林液体中固定24小时。常规石碏包埋，沿喉轴位自室带至声门下全喉连续切片，每500μm切片1张，进行HE染色。高倍光学显微镜下观察填充物的细胞及微粒形态、填充物体积、是否发生异物反应、与周围组织关系等。参考Seong KK的方法，使用autoCAD软件计算每张切片中注射材料的体积（图2）。注射材料的体积按照下列公式估算，体积＝剩余面积／每张×切片张数×0.5 mm［3］。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，组间比较用两独立样本的t检验。

2 结果

2.1 注射侧声带形态 自体脂肪与ADM微粒注射术后声带均未见明显炎症反应。术后及2周均可见术侧声带体积饱满，术后4周后声带体积明显缩小，脂肪组和ADM组术侧声带体积缩小速度同步，术后12周两组术侧声带注射部位稍隆起，与健侧对比差别不明显（图2、3）。

2.2 光镜下观察 脂肪组自体脂肪注射术后2周

在声带肌层可见填充物周围伴有炎性反应，可见成活的脂肪细胞呈团块状分布，与周围组织未形成较明显分界，术后4周炎性反应基本消失；术后8周，植入脂肪组织主要为多个囊腔，其间以纤维结缔组织相连，夹杂少量存活的脂肪细胞；术后12周，存活的脂肪细胞进一步减少，脂肪团块周围被纤维结缔组织包绕，形成明显的包膜（图4）。ADM组注射ADM术后2周，微粒间可见大量成纤维细胞长入及新生血管形成，并见炎性反应；术后4周，炎性反应基本消失，成纤维细胞逐渐增多，细胞核较大，并呈卵圆形，ADM微粒与重建后的基质区别明显；术后8周，成纤维细胞数量减少并且细胞核变小，ADM微粒较少，新生基质排列紧密；术后12周，ADM微粒基本消失，局部被新生胶原代替，新生胶原排列致密、整齐，ADM团块可见基本轮廓，但与周围组织界限不明显；ADM植入后均未见异物巨细胞反应（图5）。

2.3 注射材料体积变化 两组声带注射填充的材料体积均随时间逐渐缩小，速度差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

图1 声带麻痹模型制备前后声带形态

图2 脂肪组左侧声带自体脂肪注射后纤维喉镜下声带形态

图3 ADM组左侧声带ADM微粒注射后纤维喉镜下声带形态

图4 脂肪组自体脂肪植入后声带组织光镜观察图

图5 ADM微粒植入后光镜观察图

表1 两组自体脂肪和ADM微粒声带注射后不同时间填充物体积比较（像素，±s）

表1 两组自体脂肪和ADM微粒声带注射后不同时间填充物体积比较（像素，±s）

组别2周4周8周12周脂肪组3 036.412 2±158.308 8 2 160.803 2±66.539 7 1 528.875 6±134.494 5 1 214.2948±509.617 9 ADM组4 174.722 0±336.803 9 2 267.089 0±312.587 9 1 646.202 9±121.827 6 1 074.5765±144.215 2

3 讨论

1911年Brunings首次提出应用IL治疗单侧声带麻痹，但是受材料和当时外科技术的限制并未得到广泛应用。随着注射技术和新型材料的发展，IL的作用得到了重新认识，其适用范围也在逐渐拓展，新型生物材料的发展与优化既为临床提供了更多的选择，但也使得对于何谓最佳材料的认知普遍存在争议。

自体脂肪组织无排斥反应，能为声带提供良好的振动特性且取材相对容易，是目前临床应用最广泛的声带填充材料。Guven的研究显示，自体脂肪IL术后患者声门闭合、粘膜振动、喉粘膜感知功能、整体嗓音评级、声学和空气动力学评估均有不同程度提高，术后发声也有改善；随访1年后所有患者的吞咽功能均有改善［5］。但是自体脂肪组织的应用尚存在一些争议，其中吸收率问题尤为突出；与之相关的问题是自体脂肪获取方式、确定最初和最终填充物体积的方法影响吸收率的计算，因此，有关其实际的吸收率和持续存留时间各家报道不同，但是对于自体脂肪高吸收率均持一致观点［6～8］。Laccourreye认为自体脂肪声带注射虽然是有效和安全的手术方式，但是注射后的吸收量和效果的持续时间难以预测，与之相比喉成形术具有良好和稳定的治疗效果，因此一定程度上减少了自体脂肪声带注射的使用［］。

近年发展起来的脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）系利用物理、化学、生物等方法将同种异体或异种组织进行脱细胞、除抗原等处理，最终获得具有弱免疫抗原性的生物材料，目前已在组织工程、器官修复和重建、整形美容等领域广泛应用［10］。ADM作为多种胶原与弹性蛋白的复合物，利于成纤维细胞、内皮细胞的生长和血管的再生，最终使材料与受体组织完全一体化。有关ADM胶原网架转归的研究发现，ADM并非停留于基质状态，而是随应用部位的不同被改建为适宜的局部组织［11］。Tan等［2］的一项10年回顾性研究显示，ADM对促进声门闭合、保护气道、改善患者发声都有很好的作用；同时对患者创伤小，能减少实施永久性手术的概率，1年以上随访者中48%患者发声仍较满意。ADM具有存留时间长、改善发声效果好、生物相容性好、易注射、无创的优点，短效和长效声带注射填充都适用。

文中结果显示，自体脂肪和ADM声带注射填充后均发生较快的吸收，两者吸收速率无统计学差异。分析自体脂肪的吸收原因，多与局部未能及时建立血供，导致脂肪细胞坏死、吸收有关。ADM微粒无细胞成分，即使受区血供较差，也应不易出现液化、吸收。然而，本研究中发现ADM声带注射后吸收也较快，考虑可能与使用的浓度和材料粒径有关；Sclafani［12］的研究中发现，ADM微粒皮下注射较皮内注射吸收明显加快，以此推测可能是皮下疏松结缔组织或导致微粒更快的离散，微粒间距离扩大加速了ADM的吸收，因此，增加ADM浓度或许可以减慢其吸收。目前，ADM注射的适宜浓度没有统一的标准，临床应用中商品化的产品如Cymetra的配比是将330 mg ADM微粒加入1～2 ml的1%利多卡因［2，13］；其他动物实验报道多在150～600 mg／ml之间［12，14］，但是关于不同浓度注射的对比未见报道。ADM粒径大小影响其降解和注射，粒径小于52μm的微粒，更易被宿主细胞吞噬降解，但粒径过大则不易注射［12］。另外，局部肌肉收缩、植入物受压也可能影响其吸收速率。

从文中结果看，两种注射材料声带注射后组织学转归差异较大，自体脂肪组织随时间推移，存活脂肪细胞逐渐减少，代之以被纤维结缔组织连接的囊腔，12周时残留脂肪细胞数量极少，并且周围形成明显包膜，组织学形态与周围组织差别明显；而ADM植入后，随时间推移，成纤维细胞逐渐长入ADM微粒间，并伴新生血管形成，未见异物巨细胞反应，提示ADM组织相容性良好，在植入体内成纤维细胞合成胶原纤维和基质的同时ADM微粒自身降解，其与周围组织界限不明显。可见，ADM植入后的转归是逐渐被宿主原有组织改建、替代。此外，相对于自体脂肪组织，ADM注射创伤小、获取方便（无供体取材创伤），并且局麻下也可实施操作，具有明显优势。由此可见，ADM作为声带填充注射材料，未来有较大的拓展空间和临床应用价值。

ADM最初并非专为声带填充注射而设计，目前临床上用于声带注射的ADM制品多是通过物理方法将其进行微粒化处理，使其具备可注射性；与自体脂肪材料相比，注射ADM的填充的效果差异并不明显，因此，对ADM材料制备的优化策略，如：通过提高制作技术以延缓降解，或者进一步明确适宜的粒径、注射浓度及与其他材料复合使用，将是未来

此类材料研究的热点与方向。

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2 Tan M，Woo P.Injection laryngoplasty with micronized dermis：a 10-year experience with 381 injections in 344 patients［J］.Laryngoscope，2010，120：2460.

3 Kwon SK，Song JJ，Cho CG.Polycaprolactone spheres and theromosensitive Pluronic F127 hydrogel for vocal fold augmentation：in vivo animal study for the treatment of unilateral vocal fold palsy［J］.Laryngoscope，2013，123：1694.

4 Mallur PS，Rosen CA.Office-based laryngeal injections［J］. Otolaryngol Clin North Am，2013，46：85.

5 Guven M，Suoglu Y，Kiyak E，et al.Autologous fat augmentation for voice and swallow improvement after cordectomy［J］.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2006，68：164.

6 Kruschewsky S，Mello V，Santos C，et al.Autologous fat graft absorption in unilateral paralyzed canine vocal folds.Laryngoscope，2007，117：96.

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11 刘道峰，左金华.脱细胞真皮基质胶原网架转归的研究进展［J］.国际口腔医学杂志，2008，35：421.

12 Sclafani P，Romo T，Jacono A.Evaluation of acellular dermal graft in sheet（AlloDerm）and injectable（micronized AlloDerm）forms for soft tissue augmentation［J］.Clinical observations and histological analysis.Arch Facial Plast Surg，2000，2：130.

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（2015-02-26收稿）

（本文编辑 周涛）

Experimental Study on Acellular Dermal Matrix and Autologous Fat lnjected into Rabbit Vocal Cords

Hao Yuanyuan，Sun Jianjun
（Navy Clinical College，Anhui Medical University，Beijing，100048，China）

Objective To evaluate the clinical application of autologous fat and acellular dermal matrix（ADM）in vocal fold medialization.Methods A total of 16 New Zealand white rabbits of both sexes were divided into two study groups（8 rabbits in each group），after unilateral recurrent laryngeal nerve section，autologous fat or ADM were injected into paralyzed vocal folds.Laryngoscopic exams were performed 2，4，8，and 12 weeks after implantation；then larynx specimens were sampled and serially sectioned in axial plane from the false vocal fold to the subglottis.After section was stained with HE，histologic behavior of the graft were evaluated by optical microscope，volume of remaining material were calculated by autoCAD software.Results The remaining volume of autologous fat and ADM reduced gradually，there were no statistically significant differences between the 2 groups.In 2 weeks，fat cells survival was mass distribution，as its necrosis and absorption，intraimplant resulted in a plurality of cavitation，encapsulated by fibrous connective，mixed with a little survival fat cells.In 12 weeks，obvious capsule formation surrounded lipoma composed of fiber connective tissue.In the ADM group，2 weeks after injection，intra-implant fibroblast activity and neovascularization was noted，later fibroblast infiltration increased gradually.In 12 weeks，the implantation maintaun the basic outline and have compact organizational structure，but not forming obvious boundaries with the surrounding tissue.Conclusion Comparing degree of absorption，there were no statistically sig nificant

Vocal cord paralysis； Vocal fold medialization； Autologous fat； Acellular dermal matrix

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.04.013

时间：2015-6-17 9：54

R767.6+2

A

1006-7299（2015）04-0386-05

1 安徽医科大学海军临床学院（北京 100048）； 2 海军总医院耳鼻咽喉头颈外科

郝媛媛，女，河南人，硕士研究生，主要研究方向为言语疾病.

孙建军（Email：jjsun@sina.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150617.0954.004.html

differences between autologous fat and ADM in the study，but histological outcome of ADM is closer to the original organization.In future，ADM optimization or combination with other materials，will have a larger development and clinical application value.