一种新型的大鼠急性耳鸣模型的行为学评估方法——优化同步记录神经振荡活动

／刘行摘译 廖华审校

／1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科（武汉430060）

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一种新型的大鼠急性耳鸣模型的行为学评估方法
——优化同步记录神经振荡活动

／刘行1摘译 廖华1审校

／1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科（武汉430060）

电生理学认为耳鸣产生于听皮层的神经振荡自发性电活动，但既往行为学结合电生理学的动物模型还不能检测这一假说；研究表明对注意力的控制可能在耳鸣的感知中发挥了作用，但是对觉醒动物耳鸣的电生理学记录却很被动。耳鸣模型的评估方式主要有以下三种：Jastreboff、Guitton等采用的避免电击试验、Rüttiger等将声刺激与奖励建立条件反射以及Turner等使用的gap-PPI即间隔-惊跳反射前抑制试验检测动物是否感知耳鸣。但是这些方法都有一定的局限性，为了记录局部场电位（local field potential，LFP），神经活动需要持续数秒而动物行为控制需要相对长的时间，大多数评估方式采用不连续的刺激而影响结果，并且声刺激会干扰神经活动从而对耳鸣相关的神经自发性放电活动造成影响。为了克服这些问题，本实验采用二选一识别任务（a two-alternative choice identification task）来评估耳鸣动物模型，也就是通过选择性实验来对动物模型进行耳鸣行为学评估，这是记录耳鸣动物模型神经电生理活动的最佳检测方法。

耳鸣动物模型行为学评估方法：在隔声屏蔽室内，将大鼠置于一个透明的玻璃盒，玻璃盒中间有个中心区，中心区左侧和右侧分别有一个喂养槽，白色灯泡置于中心区上方，隔声屏蔽室顶端置一扬声器，通过置于大鼠头顶处的麦克风校准声音。大鼠的摄食量是自由喂养的摄食量的85%～90%，扬声器给声条件有三种，第一种播放稳定的窄带噪声（a steady-state narrowband noise，NBN），为1／8倍频程，中心频率随机选取4、8、16、22.6、32 k Hz之一，强度60 dB SPL；第二种播放正弦调幅宽带噪声（an amplitude-modulated noise，AM），100%调制度，中心频率为5 Hz，强度60 d B SPL；第三种为关闭扬声器，不给任何噪声刺激，为安静条件。本实验通过应答正确给予食物以强化大鼠所感知的声音，由于大鼠训练时可获得一定的食物，因此大鼠的体重增长可能和正常喂养一样，每只大鼠每天训练1小时，每小时至少进行100次试验，一周训练6天，训练成功一般需要3月。

开始训练时于隔声屏蔽室内给予持续稳定的上述声条件之一，大鼠随机将鼻子置于中区心（图1）超过4秒（等待时间）时，立刻开启位于大鼠头部上方的的白色灯光（表示＂可行暗示＂）。大鼠对给予的声条件作出正确的应答便获得食物；如果应答错误，则关闭灯光并予以20秒的超时惩罚，也就是大鼠获得食物后或者20秒之后再进行下一次训练；如果大鼠不进行应答则不进行下一次训练，下次训练时重新随机选取一种给声条件。大鼠于AM

噪声或安静给声条件将头转向右侧喂养槽或者于NBN噪声条件将头转向左侧为应答正确，则给予45 mg食物于喂养槽内；否则为应答错误。当大鼠连续5次命中正确时，可增加250毫秒的等待时间。为了减少猜测或者习惯行为采用随机给声条件：50%给予NBN噪声并随机予以不同的频率以利于大鼠对耳鸣的感知，30%给予AM噪声，20%为安静条件。当大鼠至少连续2天的命中率超过80%时，食物强化训练由100%给予逐渐变为70%给予，以减小大鼠的学习能力造成的影响。直到训练大鼠在每次给声条件下的命中率超过80%即为标准基线，一旦大鼠至少连续四天都达到标准基线便开始腹腔注射水杨酸钠或者生理盐水，每次注射前2小时训练。

每周可进行一次耳鸣检测，在检测耳鸣时，应答条件改为安静状态时既不给予大鼠食物也不给予处罚，并且需要分别给于三种声条件，大鼠感知耳鸣的表现为在安静条件下将头部转向NBN噪声侧即左侧喂养槽。如果非水杨酸钠注射组实验动物在安静条件下转头，可认为该组大鼠可能是对食物强化作用较为敏感，而非感知耳鸣；如果水杨酸钠注射组实验动物安静条件时持续准确将头转向NBN噪声侧，则为感知耳鸣（图1）。如果大鼠感知耳鸣，则其对安静声条件的命中率与其前四天比较会大幅度下滑；将正常对照组与水杨酸钠组对每种给声条件进行统计学分析，P＜0.01为有统计学差异。

研究表明高剂量水杨酸钠能导致大鼠产生暂时的耳鸣样行为，从而得到急性耳鸣大鼠模型，本实验分为水杨酸钠组和生理盐水组，每组7只大鼠，检测前2小时注射。水杨酸钠组每只大鼠予以200 mg／kg水杨酸钠（50 mg／ml）腹腔注射；生理盐水组予以等量生理盐水腹腔注射。通过上述耳鸣模型评估方法对大鼠进行耳鸣行为学评估后，分别记录分析生理盐水组与水杨酸钠组大鼠听皮层LFP变化。

本研究发现生理盐水组7只大鼠均能在安静状态正确应答，并能正确辨别NBN和AM噪声侧别；水杨酸钠组大鼠有6只在安静给声条件时持续将头转向NBN噪声侧，并能准确辨别NBN和AM噪声侧别。统计学结果表明生理盐水组和水杨酸钠组大鼠在安静状态（N＝6）的命中率有统计学差异（P＜0.001）；NBN以及AM噪声给声条件下（N＝6）两组大鼠命中率无统计学差异（P＝0.082 1和P＝0.552 1），说明生理盐水组大鼠并未感知到耳鸣，而水杨酸钠组有6只大鼠感知到耳鸣，并且大鼠对耳鸣的感知更接近于NBN噪声。在完成耳鸣大鼠模型行为学评估后，通过记录大鼠听皮层LFP以及频谱分析发现，与生理盐水组比较，水杨酸钠组的θ频带、α频带以及γ高频带功率减少，而γ低频带功率增加，分析NBN噪声和安静给声条件下的功率谱也得到了同样的结果，但AM噪声条件下γ低频带功率谱的增加中角度小于另外两种给声条件。该结果说明神经振荡活动在耳鸣的发生机制中发挥了关键作用。

本实验的耳鸣动物模型评估方法高效地检测了大鼠是否感知耳鸣，虽然大鼠处于觉醒状态，但是该方法提供了“可行暗示”之前的一段较长时间（图2），通过在大鼠听皮层植入电极，能实时、在体并稳定持续地记录分析LFP，同时排除声刺激对结果造成的影响，使得行为学和电生理学能完美结合，更好地揭示大鼠听皮层神经活动的改变，从而促进耳鸣的神经机制的研究。

图1

图2 在“可行暗示”前的等待时间为电生理记录时间

（摘译自Stolzberg D，et al.A novel behavioral assay for the assessment of acute tinnitus in rats optimized for simultaneous recording of oscillatory neural activity［J］.Journal of Neuroscience Methods，2013，219：224～232.）

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.04.031