东莞市不育男性精子功能检查参数的分析

伍玉燕等

[摘要] 目的 分析东莞地区不育男性患者精子功能相关检查结果。 方法 随机选取本院25～44岁300例诊断为男性不育患者（不育组）与200名正常生育男性（对照组）精液标本，比较两组精子形态学分析、顶体酶定量、精子DNA碎片检测及进行去透明带仓鼠卵人精子穿透实验的受精指数的差异，并将各项指标与不育进行相关性分析。 结果 不育组精子正常形态百分率（3.00±2.30）%，对照组精子正常形态百分率（8.00±4.30）%，差异有统计学意义（P<0.05）。不育组精子顶体酶活性为（69.40±31.50）?IU/106精子，对照组精子顶体酶活性（93.50±32.70）?IU/106精子，差异有统计学意义（P<0.05），不育组DNA碎片率（20.94±1.00）%，对照组DNA碎片率（11.27±0.79）%，差异有统计学意义（P<0.05）。不育组与对照组中去透明带仓鼠卵人精子穿透实验受精指数差异无统计学意义（P>0.05）。各种检查结果与不育的相关回归分析结果是，精子正常形态率与不以呈负相关（r=-0.823，P<0.05）、顶体酶活性与不育呈负相关（r= -0.723，P<0.05），与不育呈正相关的有头部畸形率（r=0.894，P<0.05）、DNA碎片率（r=0.778，P<0.05）。 结论 精子形态分析、顶体酶活性、精子DNA碎片检测是检测精子功能的有效指标。精子正常形态率、顶体酶活性与不育呈负相关关系，与不育正相关的有头部畸形率、DNA碎片率。

[关键词] 不育；精子形态；DNA碎片检测；去透明带仓鼠卵人精子穿透实验；顶体酶活性

[中图分类号] R698.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）24-18-04

The value of sperm function parameters analysis for male infertility in Dongguan city

WU Yuyan CHEN Limei WANG Bin LIU Zhigang CHEN Huinan

Department of Reproductive Medicine，Dongguan People's Hospital of Guangdong Province，Dongguan 523000，China

[Abstract] Objective To study the sperm function parameters of male infertility in Dongguan city. Methods According to the difference of the reproductive function，semen samples randomly selected and divide to two groups（25-44 years old）：300 cases of male infertility（infertility group） and 200 normal fertile men（control group）.Compare of two groups the sperm morphology index，acrosomal enzyme index，sperm DNA fragmentation index and fertility index in Zona free hamster oocyte human sperm penetration assay（SPA）.And study the parameters correlation to infertility. Results The difference of the normal sperm morphology rate was significant（P<0.05）with the infertility group（3.00±2.30）% vs the control group（8.00±4.30）%.The acrosomal enzyme index in infertility group was（69.40±31.50）?IU/106 sperm，vs the control group（93.50±32.70）?IU/106sperm，the difference was statistically significant（P<0.05）.DNA fragmentation Index in infertility group was（20.94±1.00）% vs the control group（11.27±0.79）%，with statistical significance（P<0.05）.The fertilization index between two groups in SPA had no statistical difference（P>0.05）.The normal morphology rate（r=-0.823，P<0.05）and acrosomal enzyme（r=-0.723， P<0.05）are in negative correlation to infertility，and head deformity rate（r=0.894，P<0.05）and DNA fragmentation rate（r=0.778，P<0.05）are in positive correlation with infertility. Conclusion The index of sperm morphology，acrosomal enzyme，DNA fragmentation have high clinical application value for evaluating male semen quality.The normal sperm morphology rate and acrosomal enzyme are in negative correlation to infertility，while head deformity rate and DNA fragmentation rate are in positive correlation with infertility.endprint

[Key words] Infertility；Sperm morphology；DNA fragmentation index；Zona-free hamster oocyte human sperm penetration assay（SPA）；Acrosomal enzyme

男性不育症，是指单纯因为男性因素所导致的正常性生活，未采取避孕措施一年未能使配偶怀孕。随着男方因素导致的不育比例越来越多，早期

诊断病因对治疗男性不育症尤其重要，以往对于临床医师来说，男性不育的检测指标仅有精液常规分析，这些检测项目固然为男性不育症的诊治提供了有价值的资料，可是未能反映精子全面的功能状态，目前研究最多精子功能检查为精子形态学检查、顶体酶定量、精子DNA碎片检测及进行去透明带仓鼠卵人精子穿透实验，但国内外尚无广泛临床应用，基本是作为实验研究，其正常值范围宽泛，且少有不育人群与正常人群的临床对照报道，因此严重影响到受精功能的评估。本研究通过对比东莞市不育男性与正常生育男性的精子功能相关检查的结果：精子形态学检查、顶体酶定量、精子DNA碎片检测及进行去透明带仓鼠卵人精子穿透实验，分析其与不育的关系，旨在希望获得甄选检测精子生育能力比较可靠的指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2013年9月～2014年6月生殖医学科门诊就诊的25～44岁生育期的男性作为研究对象，平均年龄（32.0±4.8）岁，按照根据生育功能差异分为不育组300例，平均年龄（33±5.2）岁，对照组200例，平均年龄（31.0±4.9）岁，两组的一般资料对比差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

不育组的入选标准：（1）依据WHO标准规律性生活未避孕一年不孕，并排除女方因素（包括女方年龄>35岁、输卵管因素、排卵问题、宫颈因素等）的男性患者；（2）未服用过影响精子功能的药物；（3）对照组的标准是为1年内令配偶正常受孕，自愿或有偿愿意提供精液检测的男性。

1.2 标本采集

检验者要求规范取精：禁欲2～7d，取精前先清洁双手，本研究取精房内通过手淫法留取全部精液标本于洁净无菌的一次性采精杯中，不得以安全套或中断性交方式留取精液，轻轻混匀，待其在37℃环境温度下20～30min完全液化后进行精子功能实验室检测。

1.3 方法

1.3.1 精液形态学参数计算方法 采用拉薄技术，Diff-Quick法染色，精子形态类型标准依据世界卫生组织（WHO）《人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室手册》（第5版）[1]，严格按照标准进行精子形态学分析，分为头部畸形、中部畸形、尾部畸形，将形态学处于临界状态的精子均列为异常精子。100倍油镜下观察200个精子形态并记录，计算正常形态精子百分率。

1.3.2 采取改良Kennedy法检测顶体酶活性值 采集新鲜精液完全液化后，根据精子密度计算标本量，得到精子量约7.5×106个；标本离心2000g×20min，弃去精浆，加入抑制剂100?L，反应液100μL，混匀后于24℃孵育lh，倒入0.5cm比色皿，分光光度计波长410nm下读取数值，顶体酶活性=（测定管OD值-对照管OD值）×106/247.5×7.5。

1.3.3 采取精子染色质扩散试验（sperm chromatin dispersion test，SCD）检测精子DNA碎片率 精液标本洗涤后加入平衡后与琼脂糖混匀，混合物滴于玻片上，冷却后酸液洗去除核蛋白，酶解液消化后脱水干燥，使用DAPI进行荧光染色，荧光显微镜观察，去除核蛋白后，精子染色质结构松散，DNA环附着于残留的核结构，形成光晕。正常的精子DNA产生扩散的光晕，而损伤的精子DNA则不产生或产生很小的光晕。记录DNA完整率、碎片率。

1.3.4 去透明带仓鼠人精子穿透实验（SPA） 可用卵子受精率与受精指数作为评估参数，受精指数更常用。卵子受精率=受精卵子数/卵总数×100。受精指数（fertilization index，FI）：由于透明带已去除，一个卵子可被多个精子穿透。FI为穿透卵子的精子总数与卵子总数之商，从整体上反映精子的穿透力与顶体反应，可按下式计算：FI=穿入卵子的精子总数/卵子总数。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间比较用t检验。以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。采用Logistic回归进行相关性分析。

2 结果

2.1 两组精子形态参数比较

2.2 两组精子顶体酶活性、DNA碎片率、FI参数比较

不育患者中，顶体酶活性为（69.40±11.50）?IU/106

精子，正常生育男性顶顶体酶活性为（93.50± 42.70）μIU/106精子，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 不育与精子形态及精子功能指标相关性回归分析

精子正常形态率、顶体酶活性、卵子受精率、受精指数与不育呈正相关关系，与不育负相关的有头部畸形率、STD、STI、DNA碎片率。

3 讨论

在正常育龄夫妇中，不育症的发病率约为10%～15%，其中单纯因男方原因所致不育者可达40%以上。东莞市虽是一个地区市，但人口众多，不孕不育夫妇队伍庞大，使得男性不育的实验室检查显得尤为重要。既往男性不育的检测指标仅有精液常规分析以及内分泌检查，这些检测项目固然为男性不育症的诊治提供了有价值的资料，可是未能反映精子全面生育能力。人精-卵融合通常在体内（IVF-ET除外）才能发生，对于体内受精过程来说，精子首先须经顶体反应获能后才能穿透卵子，其过程复杂。精-卵受精机制虽已基本阐述明白，但是临床上目前这方面国内外没有通用评估检测指标，因此要全面研究精子的生育能力，需要进行更进一步相关功能检查。目前研究最多的为精子形态学检查、顶体酶活性、精子DNA碎片检测及进行去透明带仓鼠卵人精子穿透实验。endprint

一般认为，正常形态精子率越低，精子头部畸形率越高，男性的生育能力也就越差。本研究结果显示对照组精子正常形态率为（8.00±4.30）%和不育组正常形态率（3.00±2.30）%相比，差异有统计学意义，回归分析表明，正常形态率与不育是负相关关系，头部畸形率与不育是正相关关系。因此可知精子形态学检查是评估精子手段的另一有效的补充，因操作方便，因此可广泛应用于临床，对每一位不育夫妇，均应将常规精液检查与精子形态学检查相互结合作为一线检查手段。同时，我们观察到无论对照组或不育组，正常精子形态率均较WHO第4版诊断标准低，因此第5版诊断标准更实用于当今男性精子功能评估，但也说明东莞市男性精子出现普遍生育力下降的现象，可能与本地区工业水平高污染严重有关。

从20世纪70年代，人类已经开始顶体酶与不育的研究，顶体酶是受精过程中重要的蛋白水解酶，通常以无活性顶体酶原形式存在于精子顶体内膜及赤道部膜上，当精子头部进入卵透明带时，顶体酶原被活化为顶体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与卵子融合。本研究结果对照组精子顶体酶活性（93.50±32.70）?IU/106精子，不育组精子顶体酶活性为（69.40±31.50）?IU/106精子，差异有统计学意义（P<0.05），表明男性不育症患者的精子顶体酶活性低于正常生育男性的精子顶体酶活性，是判断精子生育力很有价值的一项指标[2-4]。

既往研究表明，男性不育可能与精子DNA损伤紧密相关，本研究结果与不育正相关的精子DNA断裂水平高于生育男性[5]。有研究发现有精液指标正常的特发性不育患者。其精子DFI也增高[6]。精子DNA碎片其发生机制尚不完全清楚，一般认为与精子发生过程中异常的染色质包装、氧压胁迫或凋亡异常有关，最常用的检验方法为精子染色体扩散实验[7]。有研究报道精子DNA碎片化程度与IVF和胞浆内单精子注射（ICSI）的受精率呈显著负相关，DNA碎片化的精子形成原核障碍导致受精率降低，当DNA碎片化的精子比例超过10%时，受精率明显降低。精子DNA碎片化会导致不育、反复流产和助孕成功率低[8-10]。本研究中不育组精子DNA碎片率比正常生育男性的高，但影响不育的机制尚未完全明了，可对不育组最后需要行体外受精-胚胎移植技术助孕的患者提供最终受精资料。

去透明带仓鼠卵人精子穿透实验[11]用容易获得的去掉透明带的仓鼠卵代替人卵，把人精子与去透明带仓鼠卵子混合，培养观察受精的百分比评价精子受精能力，国外多数实验室报道结果时以低于10%～15%卵受精率为异常，已被证实是评价精子授精能力的一种可靠技术，但其操作比较复杂，影响其大范围开展。去透明带仓鼠卵人精子穿透实验包含获能和顶体反应两个过程的，本研究结果示不育组卵子受精指数值均与正常生育男性组差异无统计学意义（P>0.05），这与其他文章的结果不一致，可能的原因是本研究的不育组男性可能不存在获能与顶体反应异常问题。

本研究分析精子功能参数与不育的相关回归分析结果是，精子正常形态率（r=-0.823，P<0.05）、顶体酶活性（r=-0.723，P<0.05）与不育呈负相关关系，与不育正相关相关的有头部畸形率（r=0.894，P<0.05）、DNA碎片率（r=0.778，P<0.05）。从数据显示，精子正常形态率尤其是头部畸形率对不育的相关性更强，对不育的治疗方案的选择指导意义更大。

总之，本研究结果显示精子形态分析、顶体酶定量、精子DNA碎片检测被证明是检测精子功能的有效指标，操作简单，应广泛临床应用，结合精子常规检查能为不育男性的治疗方案（自然受孕、人工授精、体外受精-胚胎移植技术）[12-14]提供更有效、全面的根据，为患者提供有效、经济、简单的助孕方案。

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（收稿日期：2014-12-01）endprint