儿童病毒性脑炎外周血淋巴细胞亚群研究

徐森懋++黄亚玲

[摘要] 目的 观察儿童病毒性脑炎治疗前后外周血淋巴细胞亚群的变化，探讨外周血淋巴细胞亚群的变化对重症病毒性脑炎预后判断的意义。 方法 选取23例重型病毒性脑炎患儿为研究对象，以重型病毒性脑炎患者年龄及性别为依据，1∶1配对选取轻型病毒性脑炎及正常体检儿童组成轻症组及对照组；流式细胞仪检测治疗前后外周血淋巴细胞亚群百分比；轻型病毒性脑炎按脑炎常规治疗，重型者在常规治疗同时应用甲强龙冲击治疗+大剂量IVIG治疗；以出院时无明显神经系统异常归为预后良好组，仍遗留各种神经系统功能障碍或死亡者归为预后不良组。 结果 重症组CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4/CD8值较轻型组与对照组明显减低（P<0.01）；重型组CD8+T、CD19+B淋巴细胞百分比较轻型组与对照组显著升高（P<0.01）； CD16+、CD56+、NK细胞百分比各组之间差异无统计学意义。重型组预后良好者CD8+T细胞百分比治疗后明显低于治疗前（P<0.01）；CD19+B细胞百分比明显低于治疗前（P<0.01）；预后差组治疗前后CD8+T、CD19+B细胞百分比无明显差别（P>0.05）。 结论 重症病毒性脑炎患儿存在T细胞和B细胞免疫功能紊乱；治疗后CD8+T细胞百分比、CD19+ B细胞百分比无明显变化提示预后不良，甲强龙冲击+大剂量IVIG治疗可能影响CD8+T细胞及CD19+ B细胞百分比。

[关键词] 病毒性脑炎；淋巴细胞亚群；预后；IVIG

[中图分类号] R725.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）24-14-05

Study on peripheral blood lymphocyte subsets in children with viral encephalitis

XU Senmao1 HUANG Yaling2

1.Department of Pediatric，Anqing Municipal Hospital，Anqing 246003，China；2.Department of Pediatric，the Affiliated Union Hospital of Huazhong Univercity of Science and Technology，Wuhan 430074，China

[Abstract] Objective To observe the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in children with viral encephalitis before and after treatment；to study the significant of the prognosis of the changes of peripheral blood lymphocyte subsets. Methods 23 cases of severe viral encephalitis children were selected as the research object，according to the age and sex，1：1 light viral encephalitis and normal children composition and the control group before and after treatment in mild group；detection of peripheral blood lymphocyte subsets and the percentage of flow cytometry；light viral encephalitis by encephalitis conventional treatment，heavy application of methylprednisolone therapy with high-dose IVIG treatment at the same time in the conventional treatment；at discharge with no obviousneurological abnormalities into good prognosis group，still left over various neurological dysfunction or deathattributed to the poor prognosis group. Results The percentage of CD3+，CD4+T lymphocyte，CD4/CD8 value of the severe group was significantly lower than that of the light group and the control group（P<0.01）；The percentage of CD8+T，CD19+B lymphocyte in severe group increased significantly more than that of the light group and the control group（P<0.01）；no statistical differences between the percentages of CD16+，CD56+，NK cells in each group.The severe group have good outcome and the percentage of CD8+T cells after treatment was significantly lower than that before treatment（P<0.01）；the percentage of CD19+B cells was significantly lower than that before treatment （P<0.01）；the percentage of CD8+T，CD19+B cells of the poor prognosis group had no significant difference between before and after treatment（P>0.05）. Conclusion T cell and B cell immune function disorder exists in children with severe viral encephalitis；after treatment，the percentage of CD8+T cell and CD19+B cells had no obvious change indicates a poor prognosis，methylprednisolone+high dose IVIG treatment may affect the percentage of CD8+T cells and CD19+B cells.endprint

[Key words] Viral encephalitis；Lymphocyte subsets；Prognosis；IVIG

病毒性脑炎的病情进展及预后和机体的免疫功能关系密切。但是，病毒性脑炎患儿临床表现的轻重程度及预后是否与外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及NK细胞变化存在相关性，有待进一步研究。免疫调节剂（甲基强的松龙和IVIG）越来越多的应用于重症病毒性脑炎，但甲强龙冲击疗法和大剂量IVIG应用是如何调节病毒性脑炎患儿机体的免疫状态，有待进一步研究。本研究运用流式细胞仪分析技术检测治疗前后外周血T淋巴细胞亚群、B细胞及NK细胞水平变化，探讨病毒性脑炎的免疫学机制以及甲强龙冲击疗法和大剂量IVIG应用影响机体免疫功能的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例来源于2009年6月～2012年12月安庆市立医院儿科收治的重型病毒性脑炎患儿23例，其中男14例、女9例，男女比例1.6∶1，年龄9个月～4岁，其中9～12个月3例，1～2岁10例，2～3岁7例，3～4岁3例。以重症患儿年龄及性别按1∶1配对选取轻症病毒性脑炎患儿23例为轻型组；体检中心正常体检儿童23例作对照组。

1.2 诊断标准

1.2.1 轻型病毒性脑炎诊断标准[1] （1）急性起病，发病前2周内有呼吸道感染或肠道感染病史，或明确病毒感染病史，如手足口病、轮状病毒检查阳性；（2）有脑膜或脑实质损害的临床表现如脑膜刺激征、精神症状、抽搐、肢体瘫痪、失语、意识障碍等；（3）脑电图异常伴或不伴头颅CT/MRI检查异常；（4）腰穿脑脊液检查结果符合病毒性脑炎改变；（5）经病毒性脑炎诊疗常规治疗后有效或好转；（6）排除其他中枢感染性疾病如化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎及肿瘤、中毒性脑病等。

1.2.2 重型病毒性脑炎分型标准[2] 诊断轻型病毒性脑炎，且符合以下2条及2条以上：（1）反复抽搐或惊厥持续状态；（2）出现明显意识状态改变和精神症状如昏迷；（3）肢体运动功能障碍，肌张力异常或瘫痪；（4）出现脑干症状呼吸节律改变、无自主呼吸等。

1.3 治疗方法

轻型组入院后常规给予控制高热、控制抽搐（地西泮，苯巴比妥，咪达唑伦）、脱水降颅压（甘露醇，甘油果糖，呋塞咪）、抗病毒（利巴韦林，阿昔洛韦，更昔洛韦）等处理；重型组在常规治疗基础上给予甲基强的松龙（辉瑞制药有限公司，MG0629200509，0.5g/支）冲击治疗[20mg/（kg·d），用药3d，减量至1～2mg/（kg·d），用药3～5d]，同时予大剂量IVIG（成都蓉生药业有限责任公司，S19993042，50mL/瓶）静脉输注[1g/（kg·d），用药2d]，频繁惊厥者加用丙戊酸钠治疗。

1.4 预后评估

出院时无明显神经系统异常者归为预后良好组；出院时仍遗留各种神经系统功能障碍或死亡病例归为预后不良组。

1.5 外周血淋巴细胞亚群检测方法

收集各组病例晨起空腹静脉血，重型组病例于甲强龙冲击+大剂量IVIG应用结束7d后再次采集静脉血，由专人采用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪进行外周血淋巴细胞亚群检测，试剂CD45PERCP/CD3FITC/CD8PE/CD4APC及CD45PERCP/CD3FITC/CD16PE+CD56PE/CD19APC均源自美国BD公司。

1.6 统计学方法

使用SPSS13.0统计软件，建立数据库并进行统计学处理；计数资料采用百分比（%）表示，符合正态分布的计量资料测定结果用（）表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD法，治疗前后方差齐性的计量资料比较采用配对t检验；不满足正态分布的计量资料测定结果用中位数P50（P25，P75）表示，采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重型组12例（52.17%）预后良好

11例（47.83%）预后不良，其中死亡1例，因无自主呼吸而不能脱机达30d家长放弃治疗1例，出院时诊断脑炎继发性癫痫6例（其中伴运动障碍3例，伴智力倒退2例），智力倒退2例，语言障碍1例。

2.2 各组间T淋巴细胞亚群比较

CD3+、CD4+T细胞百分比对照组、轻型组、重型组，差异不全相同，差异有统计学意义（P<0.01），其中，CD3+T细胞百分比轻型组较对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），重型组较轻症组下降；重型组较对照组下降，差异有统计学意义（P<0.01）；CD4+T细胞百分比轻型组较对照组差异无统计学意义（P>0.05），重型组较轻症组下降，差异有统计学意义（P<0.01）；重型组较对照组下降，差异有统计学意义（P<0.01）。CD8+T细胞百分比和CD4+/CD8+值轻症组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），重型组较轻症组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；重型组较对照组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 各组间B淋巴细胞、NK细胞比较

CD19+B淋巴细胞 对照组、轻型组、重型组依次增高（P<0.01），其中，轻型组较对照组无显著差异（P>0.05），重型组较轻型组明显增高（P<0.01）；重型组较对照组明显增高（P<0.01）；NK细胞CD16+、CD56+百分比对照组、轻型组、重型组间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 预后好组治疗前后各组外周血淋巴细胞亚群比较

预后好组治疗后CD3+T细胞百分比较治疗前上升（P<0.05），CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+较治疗前上升，差异有统计学意义（P<0.01）；CD8+T细胞、CD19+B细胞百分比较治疗前下降，差异有统计学意义（P<0.01）、NK细胞百分比治疗前后差异无统计学意义（P>0.05），见表3。endprint

2.5 预后差组治疗前后各组外周血淋巴细胞亚群比较

预后差组治疗后CD3+T、CD4+T细胞百分比、CD4+/CD8+较治疗前上升，差异有统计学意义（P<0.01）；CD8+ T细胞、CD19+B、NK细胞百分比治疗前差别差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

病毒性脑炎的急性期病理变化表现为大量病毒入侵脑组织后导致脑组织的直接破坏；同时宿主对病毒抗原发生强烈免疫反应，将进一步导致脱髓鞘、血管与血管周围脑组织损害。病毒性脑炎的病情进展及预后和机体的免疫功能关系密切，在本研究中，重型组CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+值较轻型组与对照组明显减低（P<0.01）；CD4+T细胞为辅助性淋巴细胞，主要作用是分泌细胞因子调节免疫系统中其他细胞的活性，Miao等[3]发现在严重脑损伤患者中CD3+、CD4+数量下降，CD4+T淋巴细胞百分比下降提示重症病毒性脑炎患儿机体免疫调节功能受到抑制，从而致患儿免疫功能紊乱；同时，重型组CD8+T、CD19+B淋巴细胞百分比较轻型组与对照组显著升高（P<0.01）；CD8+T细胞的主要生物学作用为抗胞内微生物感染，发挥特异性杀伤靶细胞的功能，从而引起靶细胞的溶解与调亡，有利于病毒的清除，但同时这种特异性杀伤靶细胞的功能若过度激活，也对脑组织损害造成严重损害，有学者应用免疫细胞化学技术检测因继发严重的局灶性癫痫而行手术治疗单纯疱疹病毒性脑炎患儿的脑标本，发现脑实质有大量CD8+T淋巴细胞，并提出可能是由于T细胞介导的细胞毒性反应导致了单纯疱疹病毒性脑炎患者的脑损伤[4]；孙广超等[5]报道危重症手足口病患儿表现为B细胞百分比明显升高。病毒感染改变了突宿主细胞膜的膜抗原，病毒抗原与宿主细胞的交叉免疫反应，CTL细胞导致病毒感染的神经细胞溶解后，溶解物作为抗原刺激B细胞增殖并产生自身抗体从面引起神经组织的损伤。数据表明CD16+、CD56+、NK细胞百分比各组之间差异无统计学意义。NK细胞无需抗原刺激，无需预先致敏，具有直接杀伤靶细胞效应，且作用迅速，在体外将NK细胞与靶细胞混合后4h内即可发挥杀伤效应，在体内NK细胞通过趋化作用聚集至感染部位，在细胞因子的作用下活化，发挥杀伤靶细胞的作用，这种作用发生于特异性免疫反应之前甚至发生于病毒复制之前，而在病毒感染中后期无显变化[6]。

在预后方面，重型者在常规治疗同时应用甲强龙冲击治疗+大剂量IVIG治疗后，重型组预后良好者CD8+T细胞百分比治疗后明显低于治疗前（P<0.01）；CD19+B细胞百分比明显低于治疗前（P<0.01）；预后差组治疗前后CD8+T、CD19+B细胞百分比差异无统计学意义（P>0.05）。病毒入侵中枢神经系统之前已通过病毒血症感染到各器官，在局部组织对病毒感染产生炎症反应，产生各种细胞因子，当炎症反应过度时则可引起SIRS和（或）MODS[7]，而甲强龙冲击可有效抑制过度的炎症反应；徐娟等[8]研究表明糖皮质激素应用后会出现CD8+T细胞减少，用糖皮质激素的目的是减少过强的免疫反应对组织的损伤，甲强龙的剂量一直有争议，在本研究中采用大剂量甲强龙后有5例出现消化道出血[9]，但对症处理后均好转，故用药剂量及时机选择十分重要，也值得进一步研究探讨；有研究表明IVIG通过可下调患儿血中IL-6和TNF-α等损伤性细胞因子水平，从面缓解脑组织的损伤[10]，Amran等 [11]认为免疫球蛋白通过干预细胞因子的产生而抑制T细胞活化与增殖，Dennert等[12]报道应用IVIG治疗后李自普等研究表明儿童重症病毒性脑炎应用丙种球蛋白后，其预后较未应用丙种球蛋白组明显要好，与本文有相似之处；有研究表明大剂量IVIG输注有治疗癫痫的作用，同时使体内IgG水迅速增高，从而反馈性抑制了CD19表达，继而达到免疫调节的作用[13]。

综上所述，重症病毒性脑炎患儿存在T细胞和B细胞免疫功能紊乱；甲强龙冲击+大剂量IVIG治疗后，预后较好者CD8+T及CD19+B细胞细胞百分比治疗后明显低于治疗前（P<0.01）；预后差组治疗前后CD8+T、CD19+B细胞百分比无统计学意义（P>0.05），从而推测甲强龙冲击+大剂量IVIG治疗有可能影响患儿CD8+T细胞及CD19+B细胞百分比，对恢复重症病毒性脑炎患儿异常的免疫状态有一定作用。

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（收稿日期：2014-08-18）endprint