三维荧光光谱(3D-EEM)技术在溶解性有机质(DOM)分析中的应用

朱大伟，武道吉，孙翠珍，张志斌

(山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南 250101)

DOM的传统分析方法通过离子交换树脂富集后利用核磁共振、红外光谱等进行分析。采用离子交换树脂法可以对DOM所有组分进行完全的分离，相关操作模拟自然生态条件进行，但对DOM浓度小于5 mg/L的水样存在一定的局限性［5］，且重复使用树脂可能得不到疏水酸性物质(HPOA)，分离组分中也可能会含有微量的杂质［6］，整个试验过程冗长、样品消耗量大，分析过程较为复杂。

目前，随着仪器分析技术的发展，科研人员从光谱学领域出发，逐步推广采用光谱技术对DOM进行试验分析。与传统分析方法相比，三维荧光光谱灵敏度高，比一般分析方法高出2～3个数量级，选择性较好［7］，样品消耗量小且不破坏样品结构，采用该技术分析水样中DOM效果显著。

1 三维荧光光谱技术机理

电子激发态的多重度M=2S+1，其中S为电子自旋量子数的代数和(0或1)。自旋配对即分子同一轨道里的两个电子自旋方向相反。假如激发后电子在跃迁过程中，自旋方向没有变化，分子中的电子全部是自旋配对，那么此时分子便处于激发的单重态(singlet state)，即S=0。但如果激发后电子在跃迁过程中，自旋方向发生变化，那么分子此时便处于激发的三重态，即S=1。图1为荧光产生原理的雅布隆斯基分子能级图，T1代表第一电子激发三重态，S0、S1、S2分别代表分子的基态、第一电子激发单重态(first excited state)和第二电子激发单重态(second excited state)。

图1 雅布隆斯基分子能级图Fig．1 Jablonski Diagram

光在照射的过程中被DOM吸收，入射光的能量传递给有机物分子。当它被激发后，原子核周围的一些电子会从较低能级的轨道跃迁至较高能级的轨道，即从基态跃迁至激发态，整个过程约10-15s，而两个能级间的能量差就是它所吸收的能量。由于激发态是不稳定的，会通过辐射跃迁(发射荧光)或非辐射跃迁(振动弛豫、内转换和系间窜越)恢复至基态，这样当电子从激发态恢复到基态时，伴随着能量以电磁辐射的形式释放，即产生荧光，这就是3D-EEM技术能够分析DOM的机理。

三维荧光光谱图中三维分别是指激发波长、发射波长及对应的荧光强度。它有两种表现形式，三维荧光投影图和二维荧光等高线图，后者较前者能够克服图谱中光谱峰遮掩的问题，更丰富地表达光谱峰的位置及荧光强度所揭示的信息。水体中DOM组成不同，浓度不同，它们的三维荧光光谱图也不尽相同，因此也称三维荧光光谱技术为“fingerprint”(指纹)技术。

由于水体中DOM是多种有机物组分的混合物，在三维荧光光谱图中，不同组分的光谱峰位置重叠导致的遮掩会带来一定的视觉误差，故采用数学分析方法对三维荧光光谱图进行处理，如主成分分析法 (principal component analysis， PCA)和PARAFAC，将不同组分的三维荧光光谱图提取分离出来。

PCA利用降维的思想将三维荧光光谱图中的数据信息进行分析，提取出几个新的变量，它们是原变量的线性组合，且能够最大限度地表征原变量所包含的信息。PARAFAC基于三线性分解理论，采用交替最小二乘方法(alternating least squares method，ALS)实现，它将三维荧光光谱图分解为多个(一般为3个)独立的二维荧光光谱图，以便提高光谱识别的准确性。与PAC相比，PARAFAC的解是唯一的，因而可以避免由于操作人为造成分析结果的误差［8］。

式中：Δii为托架某次调姿过程中的整体误差项系数乘以误差项(即(Tpθ·δpθ)k中某行);f(x1,x3,,x36)为去除结构误差x2,x22后，其余结构误差对Δii的影响。线性相关列对应的结构误差项无法单独辨识，只能辨识出结构误差项对托架整体误差项的综合影响。同理，可将x3+x24,x4+x30,x5+x36作为单一整体进行求解。因此，令：

2 三维荧光光谱技术的影响因素

根据产生荧光所需的条件，三维荧光光谱技术的影响因素可以分为内部结构跟外部环境两个方面。

2．1 内部结构

(1)跃迁类型

分子产生荧光主要的跃迁类型为π→π*跃迁。对于大部分的荧光有机物，首先由nπ→π或π→π*激发，然后通过振动弛豫或其他辐射跃迁，发生π*→n或π*π→跃迁从而得到荧光。研究发现，π*π→跃迁能够得到较强的荧光［9］。

(2)刚性平面结构和共轭效应

荧光现象通常发生在具有刚性平面结构以及电子共轭体系的分子中［10］，芳香族化合物是典型的具有荧光性的物质。有些有机物(如8-羟基喹啉)虽然具有π-π共轭双键，但是不具有刚性平面结构，分子也不处在同一个平面中，这些有机物本身是不会发出荧光的，当它们与金属离子形成配位聚合物后，由于分子平面结构的增大，分子刚性结构的增强，这些配位聚合物常常也能够发出荧光。因此ππ共轭双键是物质荧光性的必要条件，π电子的共轭程度与物质的荧光强度成正比关系。

(3)取代基效应

芳香族化合物苯环上的取代基对它的荧光强度有很大的影响。—OH、—CN和—NH2等给电子基团能够增强荧光强度，而—NO2、—C==O、—COOH和卤素等吸电子基团则会使荧光强度减弱甚至发生猝灭［11］。

2．2 外部环境

(1)pH

一般来说，在相同溶液环境下，DOM的荧光强度会随着pH的增加而增大，这主要与结构中的酸性基团和自身随 pH改变的分子构型有关［12］。GHOSH等［12］发现DOM分子在高pH时呈线性结构，而在低pH时发生卷曲。对于芳香族化合物与金属离子形成的配位聚合物，pH不但会影响它们的形成，还会影响它们的组成，从而影响到它们的性质。比如，邻二羟基偶氮苯与Ga3+在pH为3～4的条件下可形成1∶1的配位聚合物，可产生荧光;但在pH为6～7的条件下则会形成1∶2的配位聚合物，不能产生荧光［8］。

(2)温度

温度也是影响DOM荧光强度的一个重要因素。李红军等［13］进行不同温度对荧光素钠溶液荧光强度的测试表明，随着温度的降低，DOM的荧光强度和荧光量子效率都会增大，而当温度升高时，DOM的荧光强度就会降低。这主要是由两个方面造成的，一是分子内部能量的转化，二是碰撞的频率。

(3)金属离子

DOM与金属离子形成配位聚合物会因它们之间的相互作用而引起荧光猝灭。在过量Cu(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的条件下，DOM中类富里酸的荧光强度会发生一定的猝灭［14］。傅平青等［15］应用三维荧光光谱技术研究DOM与Hg(Ⅱ)间的相互作用，结果表明在自然水体环境中，Hg(Ⅱ)是DOM的强有机配位体，DOM的荧光基团能够被Hg(Ⅱ)在一定程度上猝灭。另外，Cu(Ⅱ)也是DOM的荧光猝灭剂。

(4)散射光

这里的散射光主要是指拉曼散射(Raman scattering)和瑞利散射(Rayleigh scattering)。拉曼散射是由于处在激发态的分子没有跃迁至基态而偏离原来的能级，到达稍高或稍低的能级。瑞利散射与水体中粒子的浓度和体积有关。去除散射光影响的办法主要有加权法、空白去除法和插值法等。

(5)溶剂效应

溶剂的影响分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应是指溶剂的介电常数n与折射率ε对荧光强度的影响。特殊溶剂效应是指荧光物质与溶剂间的化学作用，它对荧光强度的影响会大于一般溶剂效应［9］。肖雪等［16］研究了溶剂效应对苯酚三维荧光光谱特性的影响，结果表明苯酚的光谱峰位置并未随溶剂的改变而发生明显位移，而荧光强度则有显著差异，在纯乙醇中的苯酚荧光强度大于在纯水中的苯酚荧光强度。

3 三维荧光光谱定性分析

不同的有机物组分都有其特定的最大激发波长和发射波长，因此可以根据对应的光谱峰位置实现对荧光组分的定性分析，它包含了与有机物结构、动力学、官能团等有关的大量信息［17］。常见的有机物光谱峰位置如表1所示。

表1 三维荧光光谱技术常见有机物光谱峰识别位置Tab．1 Summary of Fluorescent Peak Position of Organic Matter by 3D-EEM

4 三维荧光光谱技术应用现状与展望

祝鹏等［23］利用PARAFAC对太湖水样的三维荧光光谱图进行处理，通过对得到的DOM各种组分的光谱峰值与原始三维荧光光谱中各种组分光谱峰值进行比较，可以认为在进行分析时，利用前者代替后者是可行的。施俊等［24］采用3D-EEM技术分析污水处理厂进出水水质，通过拟合进出水中的光谱峰处的荧光强度与常规指标间的关系，发现λEx/Em=225/340和λEx/Em=230/430处可以用来对城市生活污水中铵态氮和总氮进行在线分析和实时监测。郝瑞霞等［25］采用3D-EEM技术研究了生活污水中DOM的荧光特性，发现光谱峰处的荧光强度与TOC或COD都有良好的线性关系。吴静等［26］基于3D-EEM技术分析北京城市水体，研究表明三维荧光光谱图可以展示污染的程度及污染来源。宋晓娜等［27］利用3D-EEM研究太湖表层和底层水体DOM组成和分布，对不同湖区DOM的来源进行分析，结果表明大部分湖区水体的DOM以类蛋白质为主，DOM的分布存在区域差异性，并且光谱峰处的荧光强度与各类水质常规指标呈显著相关性。闫丽红［28］对黄东海春秋季水样进行表、中、底层有色可溶性有机物(colored dissolved organic matter，CDOM)进行了分析，研究表明3D-EEM能够鉴别出黄东海水体CDOM中有10种荧光组分，CDOM发色团与类腐殖质组分有相似性质，CDOM的组成和性质具有明显的季节性变化和迁移转化。黄昌春等［29］基于太湖全湖样点的CDOM三维荧光光谱数据，结合后平行因子分析法研究CDOM的组成成分及其荧光光谱特征，研究结果根据荧光基团的类别，将太湖的CDOM源类型分为四类，即(1)陆源主导类型;(2)偏陆源主导类型;(3)偏海源主导类型;(4)海源主导类型。

目前国内外对三维荧光光谱技术的研究大多处于实验室阶段，这可能是由以下几个方面的原因造成的。(1)尚有未知的组分来源及特征不确定;(2)PARAFAC还需要有进一步验证与探索的必要;(3)暂时还没有统一的DOM组分荧光特性指标的标准［30］。为了使三维荧光光谱技术能够更广泛地应用于实际问题，今后的研究重点应该从以下几个方面来考虑:(1)利用现代化先进仪器分析设备，更为深入地研究DOM组分;(2)进一步研究PARAFAC，推动三维荧光光谱技术与PARAFAC的联用;(3)建立DOM三维荧光光谱指纹数据库，为将来快速识别分析研究提供帮助。

5 结语与展望

三维荧光光谱技术与PARAFAC联用是研究水体中DOM的有效手段，对DOM分析具有经济、高效、选择性好、灵敏度高且不破坏样品结构等优点，尤其是在处理水样中低浓度DOM方面，有广阔的应用前景。

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