姜黄素与灵芝孢子对非酒精性脂肪肝SREBP-1cmRNA的影响①

韩东东，张东东，赵芸鹤，梁衍锋，贾 楠，毕 博，张洋洋，黄 如，徐永记，郭 蒙，曹启博，宫天宇，张 雷

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学基础医学院, 黑龙江 佳木斯 154007)



姜黄素与灵芝孢子对非酒精性脂肪肝SREBP-1cmRNA的影响①

韩东东1，张东东2，赵芸鹤1，梁衍锋2，贾 楠1，毕 博1，张洋洋1，黄 如2，徐永记2，郭 蒙1，曹启博2，宫天宇2，张 雷1

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学基础医学院, 黑龙江 佳木斯 154007)

目的：分别研究姜黄素与灵芝孢子对非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)小鼠肝脏固醇调节元件结合蛋白 1c(sterol-regulatoryelementbindingprotein-1c,SREBP-1c)表达的影响，从分子水平对比不同中药对于NAFLD的治疗作用。方法：采用RT-PCR方法对比不同分组(正常组、NAFLD模型组、姜黄素干预组、灵芝孢子干预组)小鼠肝脏SREBP-1c的mRNA表达。结果：与正常组对比，SREBP-1cmRNA在模型组表达明显增高，而在姜黄素干预组及灵芝孢子干预组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。两种中药干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：NAFLD模型组肝脏中SREBP-1cmRNA的表达明显增高；姜黄素与灵芝孢子对于NAFLD小鼠肝脏SREBP-1cmRNA表达的影响无明显差异。

非酒精性脂肪肝；姜黄素；灵芝孢子；固醇调节元件结合蛋白 1c

非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是指无过量饮酒史、病毒感染或其它特定病原体感染史，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征[1,2]，发病机制较为复杂。固醇调节元件结合蛋白1c(sterol-regulatoryelementbindingprotein-1c,SREBP-1c)与肝脏脂质代谢密切相关，可在转录水平调节脂质合成相关酶等基因的表达，并可与UPR信号通路协同作用，通过内质网应激促进NAFLD的发生发展[3]。各种研究表明，姜黄素和灵芝孢子均具有保肝护肝作用[4～8]。姜黄素为橙黄色结晶粉末，从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取而来。有报道显示[8]灵芝孢子能明显降低注射四氯化碳引起肝纤维化模型中血清ALT及肝脏甘油三脂。本研究以姜黄素及灵芝孢子保肝护肝作用为基础，对比二者干预NAFLD后小鼠肝脏SREBP-1cmRNA的表达，从分子水平探讨姜黄素及灵芝孢子对NAFLD的治疗机制。

1 材料和方法

1.1 材料

95%姜黄素及灵芝孢子(药物研究所)；引物、DEPC(上海生物工程技术有限公司)；匀浆振荡玻珠(北京冬璞泰和科技有限责任公司)；琼脂糖(美国Sigma公司)；TAKARA反转录试剂盒、TAKARARNAisoPlus、DL1000DNAMarker(大连宝生物工程有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型及分组

将适应性喂养3d的60只雄性昆明种小鼠随机分为4组：正常组、NAFLD模型组、姜黄素干预组、灵芝孢子干预组。正常组正常饲养，其余组均饲高脂饮食(自制，包括：基础饲料80.5%、蛋黄粉10%、猪油7%、胆固醇2%及胆盐0.5%)。4周后姜黄素干预组和灵芝孢子干预组分别强饲姜黄素及灵芝孢子生理盐水混浊液，正常组和模型组用同体积生理盐水替代。3个月后取模型组肝脏进行HE染色，确定造模成功后取材。

1.2.2RT-PCR

(1)实验准备：用1‰DEPC水将所有接触RNA的器具浸泡24h，高温高压灭菌并蒸发DEPC后烘干备用。

(2)总RNA提取及检测：按照TAKARARNAisoPlus试剂盒说明操作。①匀浆 肝组织50mg，加入适量振荡玻珠及RNAisoPlus振荡匀浆，低温离心机预设4℃、12,000g，离心5min，取上清液；②氯仿，低温4℃、12,000g，离心15min，取上层水相；③异丙醇，等体积，低温4℃、12,000g，离心10min，弃上清，管底为RNA沉淀；④75%DEPC酒精清洗，室温干燥10min，RNase-free水溶解，检测RNA质量，调整浓度后反转录或-80℃保存。

(3)反转录：按照TAKARA反转录试剂盒说明书步骤进行反转录，所得cDNA可保存在-20℃冰箱。 (4)PCR：SREBP-1cmRNA的扩增片断长度为257bp，其上游引物为5’-TGGCTTGGTGATGCTATGTT-3’，下游引物为5’-TAAGGGGTTGGGAGTAGAGG-3’。GAPDH内参的扩增片断长度为452bp，其上游引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯照相保存。

1.3 统计学方法

2 结果

如图1、2、3显示，4个实验组均可在452bp处见到GAPDH的扩增产物条带，在257bp处见到SREBP-1c的扩增产物条带，与目的基因产物长度吻合。计算SREBP-1c与GAPDH的扫描图像净光密度数值比值后，经方差分析显示小鼠肝脏组织的SREBP-1cmRNA在模型组表达增高，在姜黄素干预组和灵芝孢子干预组表达均降低。经统计学分析，正常组、模型组、姜黄素干预组之间相比较差异有极显著性意义(P<0.01)；组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。正常组、模型组、灵芝孢子干预组之间相比较差异有极显著性意义(P<0.01)；组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。姜黄素干预组与灵芝孢子干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 正常组、NAFLD模型组GAPDH、 SREBP-1cmRNA的RT-PCR反应条带

图2 姜黄素干预组GAPDH、SREBP-1cmRNA的RT-PCR反应条带

图3 灵芝孢子干预组GAPDH、SREBP-1cmRNA的RT-PCR反应条带

表1 4组动物肝脏组织SREBP-1c mRNA半定量分析

3 讨论

固醇调节元件结合蛋白 (sterol-regulatoryelementbindingproteins,SREBPs) 有3种同型异构体(SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2)，无活性前体与内质网膜及核膜相连， 内质网应激时因固醇耗竭导致SREBPs从膜上脱离，使启动子激活而上调脂肪酸和胆固醇的生物合成[9]。SREBP-1c在肝脏表达较高，是调控脂肪酸和甘油三酯合成基因的主要转录因子，能通过脂肪酸上调CYP2E1和CYP4A的表达而促进肝内氧化应激和脂质过氧化，诱导NAFLD发生[10]。本实验结果显示，与正常组相比，NAFLD模型组SREBP-1cmRNA的表达增高，差异有显著性(P<0.05)。说明NAFLD肝脏中SREBP-1cmRNA的表达明显增高，与Horton[9]和XuYJ[11]等研究结果一致。与模型组相比，肝脏SREBP-1cmRNA在姜黄素干预组和灵芝孢子干预组中表达均降低，差异有显著性(P<0.05)。说明姜黄素和灵芝孢子对于NAFLD均有一定的治疗效果，二者均可通过降低肝脏中SREBP-1cmRNA的表达，进而可能通过影响肝脏内质网应激和调节脂代谢来影响NAFLD的发生发展。SREBP-1cmRNA在姜黄素干预组与灵芝孢子干预组间表达差异无统计学意义，显示两种中药对于小鼠NAFLD的SREBP-1cmRNA调节无明显差异，可继续对比对其他调节因子的影响或进一步开发灵芝孢子的保肝护肝价值。

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[6]梁衍锋，张东东，孙俐俐，等.姜黄素对非酒精性脂肪性肝病ApoB100与SREBP-1c的影响[J].中国老年学杂志，2013,33(21): 5381-5383

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The effects of Curcumin and ganoderma lucidum on the expression of SREBP-1c mRNA in NAFLD

HANDong-dong1,ZHANGDong-dong2,ZHAOYun-he1,LIANGYan-feng2,JIANan1,BIBo1,ZHANGYang-yang1,HUANGRu2,XUYong-ji2,GUOMeng1,CAOQi-bo2,GONGTian-yu2,ZHANGLei1

(1.College of Clinical Medicine, Jiamusi University, Heilongjiang, Jiamusi 154002, China;2.College of Basic Medicine, Jiamusi University,Jiamusi 154007, China)

Objective: To investigate the relationship between sterol-regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c) and NAFLD in liver of mice interfered by curcumin and ganoderma lucidum. Methods: The expressions of SREBP-1c mRNA in liver were tested by RT-PCR in normal group, NAFLD model group, treatment group by curcumin and ganoderma lucidum. Results: The expression of SREBP-1c mRNA was increased in NAFLD model group, and decreased in treatment group by curcumin and ganoderma lucidum (P<0.05).TheexpressionofSREBP-1cmRNAwasnotsignificantlydifferentbetweentreatmentgroupbycurcuminandganodermalucidum(P>0.05). Conclusions: The expression of SREBP-1c mRNA was increased in NAFLD model group. There are not significant differences in the expression of SREBP-1c mRNA between curcumin and ganoderma lucidum.

non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD); curcumin; ganoderma lucidum; sterol-regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c)

佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：XSYD2014-013；佳木斯大学大学生创新创业训练计划项目，编号：2014XJ23。佳木斯大学青年基金项目，编号：Sq2014-001。

韩东东(1993～)男，黑龙江大庆人，在读本科学生。

梁衍锋(1980～)女，黑龙江哈尔滨人，硕士，讲师。E-mail:lyf_zdd@163.com。

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1008-0104(2015)03-0040-02

2015-01-20)