骨髓单核细胞移植对溃疡性结肠炎修复过程的影响①

韩宇鹏，姜 威，杨 松，李 璇，苗秋实，张晓波，鲍秀琦

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003；2.佳木斯大学基础医学院， 黑龙江 佳木斯 154007)



骨髓单核细胞移植对溃疡性结肠炎修复过程的影响①

韩宇鹏1，姜 威1，杨 松1，李 璇1，苗秋实1，张晓波2，鲍秀琦1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003；2.佳木斯大学基础医学院， 黑龙江 佳木斯 154007)

目的：观察移植骨髓单个核细胞(BM-MNCs)对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠病变修复的作用。方法：取SD大鼠45只，其中15只用于提取BM-MNCs，移植组及PBS组各15只，均制作UC模型，移植组及PBS组经尾静脉分别注射BM-MNCs细胞悬液及PBS液1mL。正常饲养，观察大鼠的精神、进食、活动及大便情况。并于注射后3d、7d、14d每组各处死大鼠5只，光镜下观察结肠组织病变改变。结果：移植后第14天，移植组结肠黏膜病变修复程度明显优于PBS组。结论：BM-MNCs移植可以促进UC大鼠损伤结肠组织的修复。

骨髓单个核细胞；移植；溃疡性结肠炎。

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)属炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)，主要症状有腹泻、脓血便、腹痛和里急后重。UC的病因可能涉及遗传、环境、免疫调节间复杂的相互作用等多个方面。UC病程漫长，常反复发作，治愈难度大，被世界卫生组织列为现代难治病之一。近年来，溃疡性结肠炎的发病率呈逐渐增长趋势且严重威胁病人的健康，传统治疗难以控制此病，而且存在一定的副作用和并发症，其治疗问题是目前的医学难题[1,2]。因此，迫切需要探索新的、有效的治疗手段。近年来随着干细胞研究的不断深入，人们已开始应用干细胞来治疗多种疾病，干细胞移植也逐渐试用于UC患者的治疗，为其治疗带来新的契机。

1 材料和方法

1.1 材料

健康成年SD大鼠；弗氏完全佐剂；三硝基苯磺酸(TNBS)；蛋白裂解液(SDS)；透析袋；大鼠淋巴细胞分离液；台盼蓝；水合氯醛等。

1.2 方法

健康清洁级6～8周龄SD大鼠30只，随机分为移植组及PBS组，每组15只。移植组、PBS组大鼠用免疫复合法制备UC模型。

1.2.1 家兔结肠黏膜抗原制备

取家兔结肠，分离出黏膜层，剪碎后研磨成组织匀浆，加入SDS裂解液，95℃水浴5min，除去组织匀浆中的蛋白酶，15000r/min离心10min，取上清液。将装有上清液两端扎紧的透析袋放入生理盐水中，逐渐减少生理盐水浓度，滤出上清液中的SDS。双缩脲法检测其蛋白含量(20mg/mL)，加入等量弗氏完全佐剂制成抗原乳化液。

1.2.2 BM-MNCs的提取

SD大鼠用10%水合氯醛麻醉处死，去除大鼠腿部毛发，放入75%酒精中浸泡消毒3～5min。在无菌操作条件下去除肌肉、筋膜，暴露股骨及胫骨，离断关节，将其取出，分离股骨、胫骨两端骨皮质，用剪刀在两端骨骺处分别开一个小孔，用注射器针头从小孔处插入骨髓腔中，注入5mL抗凝液，反复冲洗骨髓腔，将骨髓冲入空试管中。将骨髓液以4℃，1500r/min离心10min，去除上清液，加入2mL PBS液混合，混合后可再次离心(重复上次)。将骨髓液缓慢加入等量的大鼠淋巴细胞分离液的顶部(注意不要使其与淋巴细胞分离液混合)，以4℃，2000r/分离心15min。去除上清液至中见白色细胞层，用移液器将中间白色层细胞抽出，4℃保存。台盼蓝测BM-MNCs活细胞率。取2滴BM-MNCs悬液移入小试管中，加入1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀，用细胞计数板计数，明确成活率[3]。

1.2.3 UC模型制备及BM-MNCs移植

模型制备第1天和第14天分别将0.4mL抗原乳化剂注射于大鼠腹股沟、足跖处，第2次注射后禁食(不禁水)24h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将直径2mm长15 cm的硅胶管从其肛门轻缓插入约8cm，缓慢推入灌注液0.65 mL(100 mgTNBS/kg+50%乙醇)。灌肠后大鼠保持平躺、臀部抬高至自然清醒。24小时后，移植组大鼠经尾静脉注入1mLBM-MNCs细胞悬液(细胞含量为3×106个/mL)；PBS组大鼠注入1mLPBS。

1.2.4 组织标本处理

移植后，正常饲养，观察大鼠的精神、进食、活动及大便情况。细胞移植后3d、7d、14d，两组各取大鼠5只，麻醉后处死，剖取结肠，纵行剪开，PBS冲洗后观察结肠大体形态、黏膜损伤情况。结肠连续切成2cm为一段的肠段，4%多聚甲醛固定24h；常规石蜡包埋，连续切片(5μm)，HE染色，光学显微镜下观察组织形态变化。

2 结果

2.1 移植组及PBS组造模1d后，开始出现懒动、拱背、厌食，肛门处可见暗红色，伴黑色黏稠稀便。3d后移植组及PBS组大鼠症状达到高峰，大鼠消瘦，精神萎靡不振，毛发无光泽，大便明显减少，为稀便，黏稠，腥臭味，褐色伴有脓汁。7d后移植组大鼠精神状态略有好转，食量有所增加，但仍有少量稀便；PBS组大鼠症状无明显变化，大鼠腹围有所增大，在移植后的第6天，1只SD大鼠死亡。14d后移植组大鼠一般状态尚可，食量增加明显，仍排稀便，无脓血便，体重略有增加；PBS组大鼠食量略有增加，但症状仍无明显改善，腹围增大明显，体重明显减轻，分别在移植后的9d，13d，2只SD大鼠死亡。

2.2 3d后移植组及PBS组大鼠结肠大体标本可见回盲部结肠扩张，肛门以上13cm处至肛门见结肠黏膜广泛充血、水肿、糜烂及坏死，并可见溃疡，直径约5～10mm。光镜下：移植组及PBS组可见黏膜层凝固性坏死，黏膜下层及浅肌层可见组织坏死和出血，部分黏膜下层可见血管扩张、充血，部分固有肌层尚存，血管内皮细胞肿胀，浆膜层可见大量纤维素物质渗出。7d后移植组及PBS组大鼠结肠大体标本可见回盲部结肠扩张明显，距肛门7～11cm处结肠与周围组织形成粘连、包裹；结肠黏膜仍广泛充血、水肿、糜烂及坏死。光镜下可见移植组黏膜层坏死，黏膜下炎性细胞浸润明显，血管扩张、充血，肉芽组织增生，肌细胞增生，浆膜层表面少量纤维素物质渗出，纤维组织增生；PBS组光镜下与移植组相比较可见肉芽组织增生不明显。14d后移植组大鼠结肠大体标本可见回盲部结肠略有扩张，结肠与周围组织无黏连，结肠黏膜可见充血、水肿，表面糜烂，未见明确溃疡，局部黏膜可见瘢痕增生；PBS组大鼠回盲部结肠扩张明显，距肛门7～13cm处结肠与周围组织形成黏连、包裹，结肠黏膜仍广泛充血，水肿，糜烂及坏死。光镜下：移植组可见新生黏膜上皮及腺体，但仍可见糜烂，黏膜下可见新鲜至成熟肉芽组织，炎性细胞浸润减少(图1)；PBS组黏膜层及黏膜下层仍可见坏死，炎性渗出，下层见肉芽组织(图2)。

图1 14d移植组大鼠结肠HE

图2 14d PBS组大鼠结肠HE

3 讨论

骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)属于成体干细胞，它包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞等多种潜能干细胞，既具有自我更新和分化潜能，又能释放某些细胞因子促进神经、血管再生。国内学者谷涌泉等[4]经骨髓动员刺激后行骨髓单个核细胞移植治疗病人的下肢的缺血疗效显著，这可能是骨髓单个核细胞群中含有更多的有利于血管新生的细胞亚群。经动员刺激的骨髓内存在大量更原始的干细胞和血管内皮祖细胞, 这些细胞的分化能力更强，更利于细胞的融合和血管的新生。而其中的骨髓间充质干细胞则在骨髓细胞中含量最为丰富，在特定的条件下又可以分化为各胚层细胞，具有强大的扩增能力和多向分化潜能，是较理想的细胞来源。本实验应用免疫复合法建立UC模型，提取并移植BM-MNCs。3d后移植组及PBS组大鼠结肠组织大体及光镜下比较无明显差别；7天后移植组及PBS组大鼠结肠组织大体比较无明显差别，光镜下可见移植组黏膜下有肉芽组织增生，而对照组不明显。14d后对移植组及PBS组大鼠结肠组织进行大体及光镜下观察和比较，发现移植组肠上皮细胞再生，溃疡面愈合，无出血及渗出病变，炎细胞明显减少，可见成熟肉芽组织；PBS组仍可见溃疡存在，渗出及坏死明显，肉芽组织形成较少，炎细胞明显浸润，上皮组织未见增生。表明BM-MNCs移植对大鼠UC有明显的修复作用。作用机制可能通过BM-MNCs向病变部位定植、BM-MNCs的分化、BM-MNCs对免疫功能的调节及BM-MNCs对损伤肠道微环境的建立有关[5]。上述BM-MNCs移植对大鼠UC的修复机制，尚需深入研究。

[1]刘卓勋，颜玉，薛宇，等.贝飞达联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎大鼠IL-10表达的影响[J].黑龙江医药科学，2012，35(1)：380-339

[2]姜威，仁秀英，颜玉.溃疡性结肠炎的药物灌肠的临床疗效观察[J].黑龙江医药科学，2005，28(3)：112-113

[3]赵中男，杨建华，王莹，等.热吉普 骨髓单个核细胞移植对脊髓半横断大鼠损伤组织中髓鞘碱性蛋白表达的影响[J].黑龙江医药科学，2014，37(1)：43-45

[4]谷涌泉，张建，齐立行,等 骨髓动员刺激后自体骨髓源单个核细胞移植治疗下肢缺血的初步临床研究[J].中国修复重建外科杂志，2006，20(10)：1017-1020

[5]李海峰，赵振林.骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎的研究进展[J].临床医药实践，2013，22(6):449-453

黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201367；黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2013245。

韩宇鹏(1982～)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

鲍秀琦(1963～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：Bxq8455@126.com。

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1008-0104(2015)03-0006-02

2015-01-20)