基质金属蛋白酶-14(MMP-14)在胆脂瘤型中耳炎中的表达及意义①

张爱华，周一莎

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



基质金属蛋白酶-14(MMP-14)在胆脂瘤型中耳炎中的表达及意义①

张爱华，周一莎

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

目的:研究基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14， MMP-14)在胆脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表达特点及意义，并探讨 MMP-14对胆脂瘤型中耳炎侵袭能力的影响。方法:采用免疫组织化学染色法(SP法)检测MMP-14胆脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表达。结果:31例胆脂瘤型中耳炎上皮中MMP-14的阳性表达明显高于正常外耳道上皮中的阳性表达。其中胆脂瘤上皮表达的染色结果表现最强，多在中至强阳性，其余上皮组织中各层细胞均有不同表达，基底膜染色强。结论:MMP-14可能在胆脂瘤型中耳炎上皮的增值与骨破坏中起重要作用。

胆脂瘤；中耳炎；基质金属蛋白酶类

胆脂瘤型中耳炎(cholesteatoma of middle ear)是耳鼻咽喉科常见的疾病，是一种位于中耳乳突腔内的囊性结构，而非真性肿瘤，临床发现，胆脂瘤型中耳炎具有类似于恶性肿瘤的生物学特征，如破坏性、侵袭性、迁移性、异常调的增殖性、复发性等，但本病在病理上属于良性病变，而非恶性肿瘤[1]。这些特性能使其导致不同程度的骨质破坏，从而引起不同程度的听力损失，甚至引发前庭功能障碍及面神经麻痹一系列病症，使患者的生命安全受到严重威胁。基质金属蛋白酶( Matrix metalloproteinases MMPs)它是一类能有效降解细胞外基质中锌离子依赖型的一类蛋白酶，目前在骨质吸收与重建中的研究已取得进展，其家族中的 MMP-14是 MMPs家族中的一个Ⅰ型跨膜蛋白酶膜，活化的 MMP-14能够直接和间接的降解基底膜( BM)和细胞外基质( ECM)成份，能够降解细胞因子、生长因子受体或生长因子连接蛋白，在肿瘤细胞的浸润、转移中起重要的作用。MMP-14在MMPs中有不可代替的作用。本文中采用免疫组织化学方法来检测 MMP-14在胆脂瘤型中耳炎上皮中的分布及表达水平，根据结果进一步探讨在胆脂瘤上皮增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

31例胆脂瘤型中耳炎上皮组织标本均取自黑龙江省佳木斯大学附属第一医院耳鼻喉科2014-02～2014-11，经手术切除的后天继发性胆脂瘤型中耳炎的胆脂瘤上皮组织，术后经苏木精—伊红染色( HE染色)确诊是胆脂瘤上皮，其中，男性标本18例，女性标本13例，年龄16～61岁，平均42.6岁。另外选11例患者取外耳道正常皮肤组织作为对照。并将标本甲醛固定，再用酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

1.2 试剂

鼠抗人MMP-14多克隆抗体,SP试剂盒等均购自上海越研生物科技有限公司。

1.3 方法

所有标本都经过HE染色并明确病理诊断，切片厚度取4～5μm。MMP-14应用免疫组化SP法检测。将石蜡切片、脱蜡、水化，后用3%H2O2室温孵育10～20min，PBS 冲3min×3；经胰酶消化后37℃孵育箱25min，用PBS冲洗5min×3；再滴入血清室温孵育5min，用PBS 冲洗；加1抗MMP-14，经4℃过夜，PBS冲洗5min×3;滴入生物素标记的2抗，再经室温孵育、PBS冲洗；滴加过氧化物亲和素酶溶液， 孵育、冲洗；滴加DAB显色液，镜下观测并控制显色时间；经自来水清洗后用苏木复染、脱水、透明、封片。用已知阳性对照片作为阳性对照，用PBS 代替1抗作为阴性对照。

1.4 染色判定

本实验以细胞内染色表现棕黄色颗粒视为阳性，并以任意五个400倍镜下视野阳性细胞数比例分为：阴性(-)；弱阳性(+)；阳性()；强阳性()。阳性细胞数分别为：(15%；16%～30%；31%～50%)50%。

图1 胆脂瘤上皮的HE染色SP×400

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件包处理。采用成组设计两样本均数比较的t检验来分析胆脂瘤上皮和正常外耳道上皮之间蛋白表达水平。

图2 MMP-14在胆脂瘤上皮中阳性表达SP×400

图3 正常外耳道皮肤的HE染色SP×400

图4 MMP-14在外耳道皮肤中阴性表达SP×400

2 结果

在本实验MMP-14胆脂瘤型中耳炎上皮组织和外耳道正常上皮组织的表达分布中，以细胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性结果，胆脂瘤型中耳炎上皮表现染色较强，多为阳性至强阳性表达。外耳道正常上皮组织细胞有表达，但染色较弱。MMP-14在胆脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的阳性表达见表1。

表1 MMP-14在胆脂瘤及外耳道皮肤中的阳性表达

注:★P<0.05。

3 讨论

胆脂瘤型中耳炎是耳鼻喉科中较常见的炎性疾病，是慢性化脓性中耳炎(单纯型、骨疡型与胆脂瘤型)中的一型，虽然他叫瘤但并非真正意义上的肿瘤，他是上皮组织不断堆积而且破坏周围组织，骨质而形成的，但他也具有许多类似恶性肿瘤的生物学特征，比如侵袭性、破坏性、非正常调控下的增殖性、复发性等，胆脂瘤上皮不断堆积破坏正常中耳腔结

构和颞骨骨质。其破坏机理还未完全明了。有相关文献显示在无胆脂瘤的化脓性中耳炎(单纯型、骨疡型)中，骨吸收几乎不明显。因此推测胆脂瘤可能是颞骨骨吸收的重要因素[2]。近年来，MMPs家族在胆脂瘤型中耳炎中的作用明显受到关注。MMPs家族可通过破坏细胞外基质、降解骨胶原等途径，在病生过程中起到重要作用。在MMPs家族中目前已至少发现16种酶，其中MMP-14是MMPs家族中的特殊蛋白酶，除了具有原有的MMPs结构外，还有梭基端穿膜区(transmem-branedomainTM)，TM可使MMP-14表达为一种膜蛋白，主要分布在细胞膜表面，主要功能为降解细胞外的基质蛋白，并且是明胶酶-A酶原的表面受体激活物，目前研究表示，MMP-14可降解并破坏肿瘤患者的细胞外基质与基底膜，并且破坏阻止肿瘤细胞浸润屏障。还使MMP-2酶原激活而进一步加强作用[3]。有实验显示胆脂瘤侵袭能力与MMP-2表达灰度有显著相关性,表明MMPs在中耳胆脂瘤的骨质破坏中发挥重要作用[4]。研究证实MMPs直接参与生理及病理性溶骨机制, 其家族中的MMP-9是胆脂瘤骨质破坏中的很重要的一种酶,与胆脂瘤的破坏作用关系密切[5]。在炎症症状较重的胆脂瘤中，基底膜不连续，缺少相对胶原的免疫反应物，所以胆脂瘤骨质破坏机制是一个复杂的、多因素共同作用过程，多种影响因素之间存在着相互关系。在本次实验中显示，MMP-14在胆脂瘤上皮组织中表达了很高的水平，在正常外耳道皮肤表达低水平，表明其在胆脂瘤型中耳炎的骨质破坏中发挥重要作用。骨质的降解和骨基质内胶原的水解过程都与活性的MMP-14有关，使胆脂瘤表现出类似恶性肿瘤的侵袭性和骨破坏性。由此可见，MMP-14在胆脂瘤的侵袭性及骨质破坏过程中起到重要作用。

[1]李冬,龚树生,黄芳,等.中耳胆脂瘤研究进展及其与凋亡抑制蛋白survivin和Bcl-2的关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,21(1):39-41Z

[2]BanerjeeAR,JamesR,NarulaAA,etal.Martixmetalloproteinase-1incholesteatoma,middleeargranulationsanddeepmeatalskin:acomparativeanalysis[J].ClinOtolaryngol, 1998,23:515-519

[3]SounniNE,BaramovaEN,MunautC,etal.ExPressionofmembranetyPe1matrixmetalloProteinase(MTI-MMP)inA2058melanomacells15AssociatedwithMMPactiveationandincreasedtumorgrowthandVasculariZation[J].IntJCaneer,2002，98(1):23-28

[4]周旭峰,姚雅芬.MMP-2和CD147在中耳胆脂瘤中的表达[J]. 黑龙江医药科学, 2008，31(3):27-28

[5]李江华,张爱华,周旭峰. 中耳胆脂瘤上皮组织中OPN和MMP9的表达及相关性研究[J]. 黑龙江医药科学,2013,36(2):78-79

2014年佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2014-032

张爱华(1962～)女，黑龙江佳木斯人，主任医师，教授，研究生导师。研究方向：耳显微外科研究。

周一莎(1984～)男，黑龙江佳木斯人，在读研究生。E-mail:zhouyisha728@163.com。

R764.21

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1008-0104(2015)03-0035-02

2014-12-01)