基质金属蛋白酶-9与血管内皮细胞生长因子在肺腺癌中的表达*

王 玲，王开金，黎 联△,黎晓强，李 敏

(1.四川省自贡市第一人民医院急诊科 643000；2.重庆市江津区中心医院呼吸内科 402260；3.重庆市江津区呼吸疾病研究所 402260；4.重庆市江津区中心医院病理科 402260)



·论 著·

基质金属蛋白酶-9与血管内皮细胞生长因子在肺腺癌中的表达*

王 玲1，王开金2,3，黎 联2,3△,黎晓强2,3，李 敏3,4

(1.四川省自贡市第一人民医院急诊科 643000；2.重庆市江津区中心医院呼吸内科 402260；3.重庆市江津区呼吸疾病研究所 402260；4.重庆市江津区中心医院病理科 402260)

目的 研究基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肺腺癌表达的相关性及意义。方法 应用免疫组织化学(SP)法检测MMP-9、VEGF在30例肺腺癌组织和12例癌旁正常组织中的表达。Western blot 检测MMP-9单克隆抗体阻断MMP-9后肺腺癌A549细胞VEGF蛋白表达水平的变化，以及VEGF克隆抗体阻断VEGF后肺腺癌A549细胞MMP-9蛋白表达水平的变化。结果 MMP-9在腺癌组织表达率为63.3%，正常组织表达率为16.7%，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGF在腺癌组织表达率为70%，正常组织表达率为25%，差异有统计学意义(P<0.05)；肺腺癌组织MMP-9水平与VEGF表达率存在正相关关系(r=0.709 4,P<0.01)，并与肺腺癌的临床分期及淋巴转移状况相关(P<0.05)。VEGF高表达率与肺腺癌的临床分期及淋巴转移状况相关(P<0.05)。用MMP-9单克隆抗体阻断MMP-9可降低VEGF蛋白表达水平，用VEGF单克隆抗体阻断VEGF可降低MMP-9蛋白表达水平。结论 VEGF、MMP-9在肺腺癌高表达，在促进腺癌侵袭转移中具有协同作用。

肺腺癌； 基质金属蛋白酶-9； 血管内皮细胞生长因子

血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知最重要的促血管生成因子之一，与肿瘤的生长和转移密切相关。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一种与肿瘤侵袭和转移密切相关的蛋白酶，与血管形成过程中基底膜的降解关系密切。许多实验发现恶性肿瘤组织MMP-9、VEGF高表达，与淋巴转移及分期等密切相关，但二者在肺癌的报道较少，两者在促进肿瘤侵袭、转移中的相互关系亦不清楚。本试验选取30例肺腺癌及12例癌旁正常组织标本，应用免疫组化方法检测VEGF、MMP-9表达。体外培养腺癌A549，分别加MMP-9、 VEGF单克隆抗体后检测VEGF、MMP-9的蛋白表达变化，以探讨二者在促进肺腺癌侵袭转移的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择重庆市江津区中心医院30例肺腺癌患者手术切除的肺癌标本(2009年3月至2012年3月)，12例癌旁正常组织。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。30例肺腺癌患者中，男∶女为20∶10，年龄范围40～82岁，>60岁14例，≤60岁的16例；病灶超过3 cm的18例，病灶小于或等于3 cm的12例；伴淋巴结转移16例，不伴淋巴结转移14例；所有病例术前未行放化疗，均有完整的病历资料；据美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)2002年制定的肺癌临床分期标准[1]：Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期17例。

1.2 细胞系 人肺腺癌A549由重庆医科大学基础医学研究所已有的细胞复苏而得，细胞在37 ℃、5%CO2、含10% 小牛血清的RPMI1640培养液中培养，0.1%胰酶消化传代。

1.3 主要试剂 RPMI1640培养液购自Gibco公司，胎牛血清购自天津TBD公司，鼠抗人MMP-9、VEGF单克隆抗体(mAb)购自Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠、鼠抗人β-actin多克隆抗体、S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 免疫组织化学 按照免疫组化试剂盒说明书步骤进行MMP-9(1∶50)、VEGF(1∶50)免疫组化染色，设正常肺组织对照组，同时用与一抗相应的免疫前血清IgG代替一抗作为阴性对照，用已知阳性的切片作阳性对照，结果判定参考黎联等[2]的方法。0～1分为低表达组，≥2分为高表达组。

1.5 蛋白质印迹 细胞传代稳定后分为3个组：A549，A549+MMP-9 mAb(5 μg/mL)，A549+VEGF mAb (5 μg/mL)。待培养的细胞至90%汇合状态时，用4 ℃的PBS冲洗细胞两次,加入裂解液200 μL，冰上振荡30 min,用细胞刮充分刮取细胞，离心提取上清总蛋白，按1∶4加上样缓冲液后水煮沸3～5 min，EP管分装冻存。用Bradford法测蛋白浓度。以每孔40 μg蛋白上样，8%SDS-PAGE电泳分离，湿式电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，一抗(抗VEGF、MMP-9)用TBST按1∶500稀释，4 ℃孵育过夜，相应二抗37 ℃孵育1.5 h，化学发光法(ECL)检测条带，β-actin作内参照，试验重复3次。

1.6 统计学处理 SAS8.2统计软件，行Fisher确切概率法，Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMP-9、VEGF在腺癌组织中的表达及相关性 免疫组化结果显示，MMP-9蛋白主要位于癌细胞胞质，呈棕黄色颗粒，高表达组占63.3%(19/30)，正常组织表达率16.7%(2/12)；VEGF蛋白主要位于癌细胞胞质，呈棕黄色颗粒，高表达组占70%(21/30)，正常组织表达率25%(3/12)(图1)。在21例VEGF高表达病例中MMP-9高表达18例，而9例VEGF低表达病例中MMP-9高表达只有1例，MMP-9与VEGF表达呈明显正相关(r=0.709 4,P<0.01)。

2.2 肺腺癌组织MMP-9、VEGF表达与临床病理特征的关系 统计结果显示，MMP-9、VEGF表达水平在伴淋巴结转移的高于无淋巴结转移患者(P<0.05)，在Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)；MMP-9、VEGF表达与患者的年龄、肿瘤大小无明显相关性(P>0.05)。见表1。

2.3 MMP-9单克隆抗体阻断MMP-9后肺腺癌细胞VEGF蛋白表达的变化 终浓度5 μg/mL的MMP-9 mAb处理A549细胞24 h后，Western blot检测显示，VEGF蛋白表达水平明显下降(P<0.05)(图2)。

注：A为MMP-9的表达，B为VEGF的表达。

图1 MMP-9和VEGF在肺腺癌组织的表达(SP，×200) 表1 MMP-9、VEGF表达与肺腺癌临床病理特征的关系(n)

注：1指MMP-9 mAb浓度是0 μg/mL；2指MMP-9 mAb浓度是5 μg/mL。

图2 MMP-9 mAb处理A549细胞24 h后VEGF蛋白表达

2.4 VEGF单克隆抗体阻断VEGF后肺腺癌细胞MMP-9蛋白表达的变化 终浓度5 μg/mL的VEGF mAb处理A549细胞24 h后，Western blot检测显示，MMP-9蛋白表达水平明显下降(P<0.05)(图3)。

注：1指VEGF mAb浓度是0 μg/mL；2指VEGF mAb浓度是5 μg/mL。

图3 VEGF mAb处理A549细胞24 h后MMP-9蛋白表达

3 讨 论

现已知VEGF作用于血管内皮细胞促进毛细血管的形成，并对新生血管的内皮细胞具有强烈的抗凋亡作用，在肿瘤的血管形成中具有核心作用。对胰腺癌的研究发现VEGF在癌组织的表达明显升高，与淋巴转移、预后相关[3-4]。研究还发现肺癌组织中的VEGF表达显著高于良性及正常组织，癌组织中VEGF表达阳性者的微血管密度显著高于阴性者，腺癌组织中VEGF表达程度比鳞癌组织显著增高，这也许就是腺癌更易早期转移、进展迅速的原因之一[5-6]。

MMP-9通过降解和破坏细胞基质中最重要的Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶，以利于肿瘤血管向间质生长，肿瘤血管的微血管密度不断增加，肿瘤不断增长并向远处转移，在多种癌的侵袭转移中起着重要作用。对胰腺癌的研究表明VEGF、MMP-9在癌组织中的平均表达水平高于正常组织中的表达，提示VEGF、MMP-9与胰腺癌的发生相关，MMP-9、VEGF的表达与胰腺癌有无淋巴结转移有相关性，表明MMP-9、VEGF在胰腺癌转移过程中起重要作用，二者大体保持同步的变化[7-8]。本研究也发现MMP-9、VEGF在肺腺癌高表达，与淋巴转移及临床分期呈正相关，二者表达呈正相关。

MMP-9、VEGF在癌症发展中同步增高，二者之间的关系如何？Meadows等[9]研究发现VEGF可以激活通过RAS活化ERK通路，乳腺癌细胞及肝细胞肝癌的细胞中ERK信号途径的活化能使MMP-9基因转录，乳腺癌细胞中ERK可活化MMP-9，ERK 抑制剂PD 98059剂量依赖性抑制MMP-9表达，表明MMP-9可能是ERK 信号途径的下游分子。本研究发现阻断VEGF后MMP-9明显下降，表明肺腺癌中ERK信号通路调控MMP-9的表达。李贞等[10]研究发现，基质金属蛋白酶抑制剂GM6001可以明显抑制鼠视网膜新生血管，明显下调VEGF的表达，猜测可能是抑制了MMP-9，减弱了MMP-9分解细胞外基质，从而减少了VEGF释放。为了研究二者之间的相互作用关系，本研究体外培养肺癌细胞进行Western blot 检测显示A549细胞有VEGF和MMP-9表达，单克隆抗体阻断MMP-9后，VEGF的表达明显下降；单克隆抗体阻断VEGF后MMP-9也明显下降，表明VEGF和MMP-9存在相互促进表达的作用。

由此可见，VEGF和MMP-9除了可以促进癌细胞侵袭转移外，二者之间存在相互刺激促进的信号途径，这样就构成了一个正反馈调节环路，促进肺癌血管增生、细胞的侵袭转移，但其中确切机制仍不清楚，而深入研究二者之间的调控机制，有助于对肺腺癌生长、浸润和转移机制的进一步认识，最终为肺腺癌的诊断、治疗和预后评价提供重要帮助。

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Study on expression of MMP-9 and VEGF in lung adenocarcinoma*

WANGLing1,WANGKai-jin2,3,LILian2,3△,LIXiao-qiang2,3,LIMin3,4

(1.DepartmentofEmergency,ZigongMunicipalFirstPeople′sHospital,Zigong,Sichuan643000,China;2.DepartmentofRespiratoryMedicine,JiangjinDistrictCentralHospital,Chongqing402260,China;3.JiangjinDistrictInstituteofRespiratoryDiseases,Chongqing402260,China;4.DepartmentofPathology,JiangjinDistrictCentralHospital,Chongqing402260,China)

Objective To investigate the correlation between matrix metalloprotoinase-9(MMP-9) and vascular endothelial growth factor(VEGF) expressions in lung adenocarcinoma and its significance.Methods The immunohistochemistry (SP) was used to test the expressions of MMP-9 and VEGF in 30 specimens of lung adenocarcinoma and 12 specimens of normal paracancerous lung tissues.Western blot was used to detect the change of VEGF protein levels in lung adenocarcinoma A549 cells after blocking MMP-9 by MMP-9 mAb,and the change of MMP-9 protein levels in lung adenocarcinoma A549 cells after blocking VEGF by VEGF mAb.Results The high expression rate of MMP-9 protein in lung adenocarcinoma tissues was 63.3%,which in the normal tissues was 16.7%,the difference had statistical significance(P<0.05);the high expression rate of VEGF protein in lung adenocarcinoma tissues was 70%,which in the normal tissues was 25%,the difference had statistical significance(P<0.05);the high expression rate of MMP-9 in the lung adenocarcinoma was positively correlated with the high expression rate of VEGF(r=0.709 4,P<0.01),and which was correlated with the lymph node metastasis status and the clinical TNM stage(P<0.05).The high expression rate of VEGF was correlated with the lymph node metastasis status and the clinical TNM stage(P<0.05).Blocking MMP-9 by MMP-9 mAb could reduce the VEGF protein expression level.Blocking VEGF by VEGF mAb could reduce the MMP-9 protein expression level.Conclusion VEGF and MMP-9 are highly expressed in lung adenocarcinoma and have the synergistic action in promoting invasion and metastasis of lung adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma； MMP-9； VEGF

重庆市自然科学基金面上项目(cstc2011jjA0961)。

王玲，女，本科，主治医师，主要从事呼吸疾病研究。△

，E-mail:lilian19700925@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.009

A

1672-9455(2015)02-0161-03

2014-05-29

2014-10-25)