罗氏LightCycler Nano荧光定量PCR仪性能评价*

张 宇，李 冬，戴 燕，郑为超，万海英△

(1.同济大学附属同济医院检验科，上海 200065；2.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232001)



·论 著·

罗氏LightCycler Nano荧光定量PCR仪性能评价*

张 宇1，李 冬1，戴 燕1，郑为超2，万海英1△

(1.同济大学附属同济医院检验科，上海 200065；2.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232001)

目的 对美国罗氏公司LightCycler Nano 32孔荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪的主要性能指标进行评价。方法 按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的评价标准，评价仪器精密度、准确度、灵敏度、可报告范围、仪器间比对等指标。结果 LightCycler Nano精密度批内变异系数(CV)为2.63%、1.51%，批间CV为6.2%、4.15%；准确度与室间质控物比较，5个标本均在靶值区间内；灵敏度检测CV≤10%；可报告范围为最大稀释比例1∶100；与比对仪器的比对结果偏差结果均小于15%。结论 罗氏LightCycler Nano荧光定量PCR仪5项性能经验证后与厂家提供的性能参数相符，可以用于临床检测。

LightCycler Nano； PCR； 性能评价； 精密度

目前聚合酶链反应(PCR)定量检测技术在各级实验室中使用越来越广泛[1]，其中ABI公司7700、7500型96孔PCR仪应用较为广泛，但很多实验室对通量要求不高[2],同时大部分省市级检验科PCR结果报告时间为3 d左右，原因之一为积攒足够批量标本后进行检测，大大降低了报告及时率，一定程度上影响患者就诊效率，增加医疗开支，罗氏新推出的LightCycler Nano 32孔荧光定量PCR仪，具有中等通量，高精确度，支持快速PCR，软件分析直观，价格为常规PCR的一半，体积小等特点，能够在大大缩短运转周期的同时减低实验室成本消耗，同时能为科研个体化、低通量、快速提供一个个人化的定量平台[3]。同济医院检验科在使用LightCycler Nano后，对其主要性能指标进行评价分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 主要仪器：LightCycler Nano荧光定量PCR仪(美国罗氏公司)，低温高速离心机(德国Eppendorf公司)，生物安全柜等。试剂：乙型肝炎病毒(HBV)-PCR荧光定量检测试剂盒(日本Takara公司)。标准血清，上海临床检验中心提供。检测标本来源：收集足够量的患者血清20份。

1.2 方法

1.2.1 精密度检测 按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的评价标准EP15A要求收集两个水平(Level 2低值、Level 1高值)的患者血清，批内精密度一天各测定20次，计算平均值和变异系数(CV)值；批间精密度，每日各测一次，连续20 d，计平均值和CV值。

1.2.2 准确度检测 使用参加上海市临检中心下发的5份室间质控品进行检测，按照CLSI-EP15A规则，检测本室检测值是否落在靶值范围内或靶值在TEa(CLIA′88)允许范围内。

1.2.4 可报告范围 收集高值即检测上限(HBV-DNA 1.00×107IU/mL)患者标本。将患者标本用厂家指定的稀释液按比例进行稀释后上机检测，检测其最高稀释倍数是否高于厂家指定值(1∶100)。计算测试均值与理论值的比值，如在80%～120%之内的最大稀释度，为本室可接受的最大稀释度。

1.2.5 仪器间比对 准备5份标本，浓度覆盖医学决定水平。在基准仪器和比对仪器(ABI 7700)上检测这5份标本，每份标本检测2 次取均值计算比对仪器和基准仪器之间的结果偏差(CV)百分比。5份标本CV≤15%为符合要求。

1.3 统计学处理 采用统计软件SPSS17.0进行统计学处理，计量资料采用t检验，两变量间线性关系分析采用直线相关及回归分析。

2 结 果

2.1 仪器精密度检测结果 批内精密度：低值均值±s为4.45±0.12，CV为2.63%，高值均值±s为6.52±0.1，CV为1.51%。批间精密度：低值均值±s为4.41±0.32，CV为6.2%，高值均值±s为6.39±0.2，CV为4.15%。本室检测值均落在厂家提供的CV范围内或在TEa(CLIA′88)允许范围内。

2.2 准确度检测结果 本室检测值0、4.76、5.71、3.56、6.74均落在靶值范围内或靶值在TEa(CLIA′88)允许范围内(0～0、4.39～5.39、5.34～6.34、3.42～4.42、6.38～7.38)。

2.3 灵敏度验证结果 本室检测结果为3.543，s为0.165，CV为4.67%，符合厂家要求范围内(CV≤10%)。

2.4 可报告范围验证结果 按照厂家最大稀释倍数1∶100后，测试均值为5.98，理论值为5.81，测试均值与理论值的比值为102.84%，在80%～120%之内。1∶100为本科室可接受的最大稀释度，符合厂家提供的最高稀释倍数。

2.5 仪器间比对结果 5份标本比对仪器和基准仪器之间的结果偏差(CV)百分比分别为0.0%、0.1%、2.1%、0.3%、2.5%均小于15%符合要求。

3 讨 论

经验证罗氏LightCycler Nano 32孔荧光定量PCR仪，精密度、准确度、灵敏度、可报告范围、仪器间比对5个项目的各项性能指标与厂家提供的性能参数相符。定量PCR仪主要借助标本及标准品之间对比来实现定量[4-5]，对于定量PCR系统，重要性能除了传统PCR的升温速度及温控稳定性、精确性外，更重要的在于标本孔之间均一性，大大减少孔间差异造成的指数级放大[6]。罗氏LightCycler Nano 32孔荧光定量PCR仪，采用Therma-BaseTM热循环专利技术和先进的光学检测系统，彻底消除边缘效应，可靠的光学装置提供了完整的光谱信息，保持稳定优异的检测结果[7]。荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流[8]。支持所有常用的检测染料，不需要DOX。该仪器外形小巧，其体积为常规PCR仪体积的1/4，可随意搬动，不受实验室的空间限制。便于经常要开展实时定量PCR分析，但通量中等的实验室。

目前在临床上PCR主要用于检测各种细菌及病毒DNA，为实验诊断提供分子生物学依据。其中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA检测在各级实验室检测中最为常用。我国属HBV感染高流行区,一般人群的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性率为9.09%[9]，目前临床上常用荧光定量PCR法检测HBV-DNA，荧光定量PCR技术把PCR、杂交及光谱技术相融合,达到了对原始模板量定量的目的。HBV-DNA是HBV的遗传质,HBV-DNA(PCR)是从血清中检测HBV存在的灵敏而直接的方法[10]。LightCycler Nano 32孔荧光定量PCR仪可作为一种快速、准确的分子生物学检测仪器，其结果可以直接反映体内HBV感染状态及病毒载量情况，有利于判断疾病的严重程度和传染性,更有利于临床治疗的药物选择和疗效观察。

此外，LightCycler Nano软件设计更为直观，分析设计及数据分析一体化，大大提高了检测效率，同时小通量、支持快速PCR的设计，便于每日操作，降低检测成本，缩短报告周期。符合当今临床检验实验室，横向联合科研型实验室发展的趋势。本实验经过验证该仪器的主要性能指标，符合厂家提供的性能参数相符，可以在实验室应用于临床检测。

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Performance evaluation of Roche LightCycler Nano fluorogenic quantitative PCR instrument*

ZHANGYu1,LIDong1,DAIYan1,ZHENGWei-chao2,WANHai-ying1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTongjiHospital,TongjiUniversity,Shanghai200065,China；2.MedicalCollege,AnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan,Anhui232001,China)

Objective To evaluate the major performance indexes of American Roche LightCycler Nano 32 holes fluorogenic quantitative PCR instrument.Methods According to the evaluation standard formulated by the Clinical and Laboratory Standars Institute(CLSI),the precision,accuracy,sensitivity,reportable range and comparison between the instruments were evaluated.Results The coefficients of variation(CV) for within-run assays were 2.63% and 1.51% respectively;CVfor between-run assays were 6.2% and 4.15% respectively;comparing the accuracy with the between-run quality control material,the five samples were within the target value range;CVfor sensitivity was ≤ 10%;the reportable range of the maximum dilution was 1∶100;the bias of the comparison results with the comparative instrument was less than 15%.Conclusion The verified 5 items of performance in the Roche LightCycler Nano fluorogenic quantitative PCR instrument conform to the performance parameters provided by the manufacturer,indicating that this instrument can be applied in clinical testing in our laboratory.

LightCycler Nano; PCR; performance evaluation; precision

国家自然科学基金资助项目(81273777)；国家自然科学基金资助项目(81272603)；上海市浦江人才计划项目(13PJ1407300)；安徽省自然科学基金项目(11040606M203)。

张宇，女，检验技师，硕士研究生，研究方向是分子免疫、检验医学、中医药免疫。△

，E-mail：whysz@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.001

A

1672-9455(2015)02-0145-02

2014-05-26

2014-10-23)