宫颈脱落细胞DKK-3基因甲基化在宫颈癌中的意义

胡 玲，姜 玲，胡 姣，张 婧(.武汉市青山区第一医院妇产科 430080；2.湖北省襄阳市中心医院妇产科 4402)



·临床研究·

宫颈脱落细胞DKK-3基因甲基化在宫颈癌中的意义

胡 玲1，姜 玲1，胡 姣1，张 婧2△(1.武汉市青山区第一医院妇产科 430080；2.湖北省襄阳市中心医院妇产科 441021)

目的 检测宫颈脱落细胞Dickkopf相关蛋白3(DKK-3)基因启动子甲基化并研究其在宫颈癌中的临床意义。方法 选择宫颈癌患者(CER组)和健康女性(CON组)为研究对象，采用甲基化特异性PCR(MSP)检测两组研究对象宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化，比较DKK-3基因启动子甲基化率在不同临床病理因素中的差异。结果 CER组宫颈癌患者宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化率明显高于CON组健康女性(53.8%vs. 0.0%，P<0.01)。CER组宫颈癌患者宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化率在HPV感染、组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和国际妇产科联盟(FIGO) 分期中的差异均有统计学意义(均P<0.05)，有HPV感染、组织学分级高、肿瘤最大径大于或等于4 cm、有淋巴结转移、有远处转移和FIGO分期晚的宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率明显高于无HPV感染、组织学分级低、肿瘤最大径小于4 cm、无淋巴结转移、无远处转移和FIGO分期早的患者。结论 宫颈癌患者宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化与HPV感染、组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和FIGO分期有关，可用于评估宫颈癌的病情严重程度和预后。

宫颈癌； DKK-3； 甲基化

目前对宫颈癌的发病机制尚未完全明确，研究表明其与抑癌基因的甲基化沉默有关，这些基因的甲基化率与宫颈癌的病程严重程度和预后紧密相关[1-2]。Dickkopf相关蛋白3(DKK-3)是新近发现的抑癌基因，其甲基化沉默时导致失去对细胞周期的调控而发生癌变，与肿瘤的发生、进展与转归紧密相关[3]。研究表明，在宫颈癌组织中可检测到DKK-3高甲基化状态[4]。本研究检测宫颈癌患者宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化状态，研究宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1月至2014年1月诊治的宫颈癌患者为研究对象(CER组)。纳入标准：(1)初治患者，既往未行化疗及手术治疗；(2)经临床表现、体格检查、影像学及病理组织学检查确诊；(3)排除合并严重心脑肺及其他肿瘤患者。共纳入65例研究对象，平均年龄(47.3±6.5)岁；病理类型为鳞状细胞癌48例，腺癌11例，腺鳞癌6例；国际妇产科联盟(FIGO) (2009年)宫颈癌分期包括Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。另以同期50例健康女性为对照(CON组)，平均年龄(47.5±7.1)岁。CER组和CON组研究对象年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 材料与试剂 宫颈脱落细胞获取：将宫颈刷在子宫颈外口与颈管交界处刷转，收集子宫颈脱落细胞，然后将宫颈涂片取样器放入装有特殊溶液的试管中，轻轻摇动，使取样器上的细胞标本洗脱在溶液中。DNA提取试剂购自宝生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；甲基化检测购于北京天漠公司。

1.3 DKK-3基因启动子甲基化检测 根据DNA提取试剂操作说明提取CER组和CON组宫颈脱落细胞总DNA。采用MSP法检测DKK-3基因启动子甲基化，引物序列参考Ding等[5]文献报道序列。PCR反应体系为25 μL，循环条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性1 min，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后72 ℃延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。

2 结 果

2.1 DKK-3基因启动子甲基化 CER组65例宫颈癌患者宫颈脱落细胞检测到35例呈甲基化状态，甲基化率为53.8%，CON组50例健康女性中均未检测到甲基化状态，甲基化率为0.0%，CER组宫颈癌患者宫颈脱落细胞DKK-3基因甲基化率明显高于CON组健康女性(χ2=36.200，P<0.01)。

2.2 DKK-3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系 CER组宫颈癌患者的宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化率在年龄和病理类型中的差异均无统计学意义(均P>0.05)，在HPV感染、组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和FIGO分期中的差异均有统计学意义(均P<0.05)，有HPV感染、组织学分级高、肿瘤最大径大于或等于4 cm、有淋巴结转移、有远处转移、FIGO分期晚的宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率明显高于无HPV感染、组织学分级低、肿瘤最大径小于4 cm、无淋巴结转移、无远处转移和FIGO分期早的患者。结果见表1。

表1 CER组宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化与临床病理因素关系

续表1 CER组宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化与临床病理因素关系

3 讨 论

基因甲基化是表观遗传学中与碱基突变无关的转录前基因调控机制，甲基化CG结合甲基结合蛋白或自身结构可阻遏转录因子形成转录复合物从而调控基因表达，而基因甲基化主要集中在含CpG岛的基因启动子区域[6]。研究表明，抑癌基因启动子甲基化沉默导致其失去对正常细胞增殖的调控而发生癌变，与肿瘤的发病机制、转归及预后密切相关，越来越多的研究表明抑癌基因启动子甲基化可用于肿瘤的病情及预后评估[7-8]。DKK-3基因属于DKK家族，为Wnt信号传导通路的抑制因子，具有促进细胞凋亡和调控肿瘤血管产生的功能，在消化系统肿瘤和呼吸系统肿瘤等可检测到其处于甲基化状态，且其甲基化率可反映病情严重程度和预后[9]。目前对宫颈癌的发病机制尚未完全明确，研究表明其与抑癌基因的甲基化失活有关，随着研究的不断深入，越来越多的基因被发现参与宫颈癌的发生、发展[10]。研究表明，宫颈癌组织中可检测到DKK-3基因启动子甲基化状态，其甲基化率明显高于正常组织[4]，因宫颈脱落细胞筛查宫颈癌较宫颈切除组织病理学更方便、快捷，检测宫颈脱落细胞DKK-3基因甲基化状态对宫颈癌的筛查更有临床价值。本研究表明宫颈癌患者宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化率明显高于健康女性，证实DKK-3基因甲基化在宫颈癌发病机制中的作用。

目前公认的宫颈癌病情及预后的决定因素为组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和FIGO分期，组织分化程度低、肿瘤越大、有淋巴结转移、有远处转移和FIGO分期晚的患者其生存期越差，此外，研究表明宫颈癌患者的生存质量同样与这些因素密切相关。本研究发现宫颈癌患者的宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化率在HPV感染、组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和FIGO分期中的差异均有统计学意义(均P<0.05)，有HPV感染、组织学分级高、肿瘤最大径大于或等于4 cm、有淋巴结转移、有远处转移、FIGO分期晚的宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率明显高于无HPV感染、组织学分级低、肿瘤最大径小于4 cm、无淋巴结转移、无远处转移和FIGO分期早的患者。这些证据表明，与宫颈癌术后切除病理组织一样，宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子甲基化与宫颈癌的病情及预后紧密相关，可作为其病情及预后评估的标志物。宫颈脱落细胞筛查宫颈癌较传统的宫颈活检更具有临床价值，同时可在术前提供客观证据，这点是传统的病理组织学无法企及的。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.045

A

1672-9455(2015)01-0110-02

2014-04-22

2014-07-12)

△通讯作者，E-mail：mirror1219@sohu.com。