纳米羟基磷灰石/硫酸钙复合人工骨顺铂缓释系统注射液的制备与研究*

郑燕科，张春强，汤燕飞，余佳明，江 摩，汤善华(解放军第184医院,江西鹰潭 335000)



·论 著·

纳米羟基磷灰石/硫酸钙复合人工骨顺铂缓释系统注射液的制备与研究*

郑燕科，张春强，汤燕飞，余佳明，江 摩△，汤善华(解放军第184医院,江西鹰潭 335000)

目的 研制可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG顺铂释药系统，为骨转移瘤提供新型的局部药物缓释系统。方法 α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG载顺铂制成可注射用α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum缓释微球，研究其结构、释药特性、可注射性以及力学性能。结果 (1)第1、3、5、7天缓释微球的释药浓度分别为97.5、90.7、83.2、68.5 μg/mL，第7天后趋于稳定。(2)可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG顺铂释药系统在液固比为0.7时可注射性强，与此同时缓释药系统随着液固比的增大凝固时间延长。结论 α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG顺铂释药系统具有良好的注射性能和缓释作用。

α-半水硫酸钙； 顺铂； 局部药物缓释系统

局部药物缓释系统(DDS)因其能在局部达到较高的药物浓度，同时血药浓度低，不良反应小，为治疗骨转移瘤提供了有效的治疗用途[1-3]。羟基磷灰石(HA)作为新型生物材料问世以来，引起了材料学科和医学界的广泛兴趣。HA因其化学成分和晶体结构与人体骨骼组织的主要无机矿物成分基本相同，引入人体后不会产生排异反应，故其作为骨修复替代材料在国内外广泛应用[4]。其已被动物实验及临床研究证实具有无毒、无刺激性、良好的生物活性、生物相容性及骨传导性、较高的机械强度及化学性质稳定等特点[5]。而纳米级羟基磷灰石(nano-HA)与半水硫酸钙(CSH)复合体作为一种新型骨修复材料，无需二次手术其可行性已经得到证实[2]。本研究采用具有生物活性的nano-HA作为载体，外包裹生物相容性好且可以降解的聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚体/聚乙二醇(PHBV/PEG),承载顺铂(cis-platinum)，制成nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球，再将nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum与α-CSH复合，作为人工骨材料，对其注射性能、凝固时间、药物释放等进行研究，以了解其实际应用的可行性和科学性。

1 材料与方法

1.1 材料 α-CSH(来自Sigma公司，γ射线照射灭菌)、二水硫酸钙(CSD)、nano-HA 晶体(南京海泰纳米材料有限公司)，复合材料以CSD等为促凝剂，以生理盐水作为固化液，液/固比为0.8，α-CSH以水为固化液，液固比为0.36。聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)、聚乙二醇(PEG)购自华南理工大学材料学与工程学院。

1.2 方法

1.2.1 nano-HA-cis-platinum的制备 以质量比2∶1取nano-HA、cis-platinum，均匀混合，加入适量去离子水，超声波分散25 min，在26 ℃磁力搅拌72 h。用去离子水离心洗涤3次，浆液于-80 ℃冻干，磨成粉末，得白色冻干粉nano-HA-cis-platinum[6]。

1.2.2 载药nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球的制备 将nano-HA-cis-platinum白色冻干粉分散于含PHBV的二氯甲烷中(冻干粉与PHBV的质量比为1∶4),并加入PEG 20000(PEG20000和PHBV的质量比为2∶1)。然后迅速加入外相水中，其中含0.4%甲基纤维素(4 g/L w/v)，油相与水相的体积比为1∶10。剧烈搅拌至二氯甲烷完全挥发，以4 000 r/min离心15 min，过滤，水洗，收集固体冷冻干燥，环氧乙烷消毒备用[7]。

1.2.3 电镜观察 将少量nano-HA、nano-HA-cis-platinum、nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球加入无水乙醇溶液中震荡15 min，然后将悬浮液移到带微栅膜的铜网上，乙醇挥发。 用JEOL JEM-2100高分辨透射显微镜进行分析。nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球铺于铝箔的黏性表面，微球表面涂金，扫描电镜观察微球大小和表面形态。

1.2.4 nano-HA载药效果的测定以及复合材料体外释药实验 取cis-platinum、纯nano-HA以及载药nano-HA各20 mg的样品，溶于1 mL的二氯甲烷，加入5 mL的PBS溶液剧烈震荡10 min，静置1 h，然后取上清液，衍生法紫外100～400 nm全波段扫描，先确定cis-platinum的特征吸收峰为254 nm，再对比纯nano-HA以及载药nano-HA在254 nm处是否存在差异，以确定cis-platinum是否已经载入nano-HA。在cis-platinum的特征吸收峰处运用紫外分光光度计(UV)检测不同浓度cis-platinum的吸光度，并制作标准曲线和回归方程。将制得载药复合材料90 mg室温下浸泡于20 mL生理盐水中，浸泡24 h。吸除浸出液，用PBS冲洗3次，更换PBS液，继续浸泡。于第1、3、5、7、10、14、21、28天分别取样，每次取5 mL浸泡液作为检测样品，同时加入5 mL新的生理盐水，用UV检测计算释放药物的质量并绘制释药曲线。

1.2.5 可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的制备 取20 mL无菌注射器，样品分为两组，载药组和未载药组。1.0 g nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球或者1.0 g nano-HA/PHBV-PEG微球，1.0 g α-CSH，0.05 g CSD。以生理盐水为固化液，并按液固比加入固化液并搅拌，加入固化液开始计时。迅速搅拌均匀，1 min将浆体注入模具内，并按照相关标准进行评价材料经过注射器的注射性能，同时评价样品在不同液固比(mL/g)下的注射性能[8]。液固比值分别设定如下：载药组0.3,0.4,0.5,0.6,0.7；未载药组0.4,0.5,0.6,0.7，0.8。30 s注射1次，当浆液在注射器上无法注射时定义为凝固时间。

1.2.6 释放曲线绘制 以标准曲线计算各时间点药物浓度，用GraphPad Prism 5绘制nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum释药浓度与时间关系曲线。

1.2.7 人工骨材料注射效果评价标准 人工骨材料注射效果评价标准分为佳、可、勉强、差和极差5个等级。佳：注射顺利稳定，材料流畅顺利通过针头；可：注射属顺利但需要施加一定推助力；材料稳定通过针头；勉强：需要较大推助力方可注射，材料不能稳定通过针头；差：需要大力方可将材料从针筒推出，材料在针管中频繁受阻，注射流量极不稳定；极差：材料很难注射或完全无法注射。

2 结 果

2.1 电镜观察结果 透射镜下可见nano-HA为纳米相晶体颗粒，尺寸为30～60 nm(图1)。

图1 nano-HA呈短棒状 (透射电镜200K)

nano-HA-cis-platinum由于晶体的凝聚和表面吸附cis-platinum以及cis-platinum颗粒叠加在一起形成二次颗粒大小在100～300 nm，平均粒径为199.5 nm(图2)。

注：表面吸附大量cis-platinum。

图2 nano-HA-cis-platinum 呈晶体自然凝聚状态

注：A为 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球(扫描电镜×500);B为高分辨透射显微镜 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum形态；C为PHBV-PEG cis-platinum微球。

图3 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球与PHBV-PEG cis-platinum微球形态

高分辨透射显微镜以及扫描电镜下可见nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球大小均匀，表面形态一致，为多孔皱缩结构，平均粒径为55.4 nm，PHBV-PEG形成缓释膜。微球破裂后大微球里面有大量小微球，小微球平均粒径为8.1 nm(图3)。

2.2 复合材料体外释药效果测定 经实验证实cis-platinum的特征吸收峰在254 nm，而未载药的nano-HA在此处没有特征吸收峰(图4)。

图4 cis-platinum的紫外吸收光谱

在254 nm处测定10、20、40、60、80、100 μg/mL cis-platinum的吸光度，得到cis-platinum的标准曲线，并得其回归方程Y=0.013 8X+0.212，R2=0.982(X为样品浓度，Y为吸光度)(图5)。

图5 cis-platinum的标准曲线

第1、3、5、7天缓释微球的释药浓度分别为97.5、90.7、83.2、68.5 μg/mL，第10天后趋于稳定，体现出缓释微球良好的缓释性能,见图6。

图6 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的释药曲线

项目未载药组(mL/g)0．40．50．60．70．8载药组(mL/g)0．30．40．50．60．7注射性能差勉强勉强可佳差差勉强可佳凝固时间(min)35612232371525

2.3 注射性能以及凝固时间 生理盐水作为固化液，对于未载药组，液固比(mL/g)为0.4时不能注射，而液固比为0.5、0.6时可以勉强注射，为0.7、0.8时可以注射，0.8时最佳。对于载药组而言，液固比(mL/g)为0.3、0.4时不能注射，0.5时勉强可以注射，0.6、0.7时可以注射，0.7时最佳。凝固时间随着液固比的变大而变长。见表1。

3 讨 论

α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG-cis-platinum释药系统以α-CSH为支架，nano-HA为载药核心，外包裹可生物降解的PHBV及PEG高分子化合物而形成的，其较一般的局部药物缓释系统有不同的特性，良好的药物缓释功能，药物爆释不明显[9]。这是由其结构及组成所决定的。nano-HA//PHBV-PEG-硫酸庆大霉素微球存在大微球包裹小微球的结构，形成了多级缓释膜，膜表面存在大小不等的微米级或纳米级的孔隙[10]，保证水分的进入和药物的稀释；nano-HA的表面效应，吸附药物能力强；nano-HA尺寸效应，nano-HA之间纳米级通道；外包裹降解可调控的高分子聚合物PHBV及PEG，并以α-CSH为支架[11]。

HA和CSH都是公认的优良成骨材料。有实验证明CSH/HA复合人工骨具有良好的微孔性是各种蛋白药物的合适载体[6]。1987年Frame等尝试将它们复合以改善单一HA材料注射性能不佳的缺点。实验发现，两材料复合用于犬下颌骨缺损修复，获得了协同的成骨活性：这种复合材料不仅塑形性和充填性满意，其成骨性能甚至与HA自体骨相当[7]。Shigeru等将这种复合物注射于兔胫骨骨髓内，4周后即见新骨形成，8周已十分明显。研究所用的复合人工骨系nano-HA与CSH组成，nano-HA的晶体尺度与天然骨接近，具有更好的理化及生物学性能，动物实验已发现该复合物降解时间适当，具有良好的成骨活性[9]。

本研究研制了一种具有α-CSH/nano-HA与PHBV/PEG复合体材料的药物缓释系统，这样的药物缓释系统使得顺铂的释药时间延长，从nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的释药曲线可以看出药物突释不明显。而且在合适的液固比下，药物具有良好的注射性能。与普通的nano-HA/PHBV-PEG缓释系统相比，本研究的缓释系统采用α-CSH/nano-HA复合人工骨，使得顺铂缓释系统具有了比较良好的成骨活性。本研究使传统的抗肿瘤药物顺铂兼具药物缓释性能以及缓释系统的良好成骨性能，为骨转移瘤的治疗提供了更为广阔的应用前景。

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Preparation and study of α-CSF-nano-(HA)/ PHBV-PEG cis-platinum sustained release system injection*

ZHENGYan-ke,ZHANGChun-qiang,TANGYan-fei,YUJia-ming,JIANGMo△,TANGShan-hua

(184HospitalofPLA,Yingtan,Jiangxi335000,China)

Objective To research and prepare of α-calcium sulfate hydrate(CSH)-nano-hydroxyapatite(HA)/PHBV-PEG cis-platinum drug release system to provide the new type local drug sustained release system for metastatic bone tumor.Methods Cis-platinum was loaded into n-HA by the ion exchange method.The drug loaded n-HA was mixed with CSH(1∶1) and coated with compomer poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)(PHBV) and polyethylene glycol(PEG).The injectable α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum sustained release microspheres were prepared.The release characteristics,injectability and mechanical property were researched.Results (1) The drug release concentration of the sustained release microspheres on 1,3,5,7 d the cis-platinum concentration was 97.5,90.7,83.2,68.5μg/mL respectively,and then the concentration trended to be stabilized.(2)When the liquid/solid ratio was 0.7,the injectable α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum drug delivery system has a strong injectability.At the same time the coagulation time was extended along with the increase of liquid/solid ratio.Conclusion The α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum drug delivery system has the better in vitro releasing effect and injection property.

α-calcium sulfate hemihydrate； cis-platinum； drug delivery system

南京军区科技创新课题(08Z017);江西省科技计划项目(2012BBG70038)。

郑燕科，男，主治医师，硕士，主要从事骨肿瘤基础与临床研究。△

，Email：jiangmoqq123@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.008

A

1672-9455(2015)01-0019-03

2014-04-24

2014-09-19)