两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒RNA检测效果的比较及应用评价

范公忍,陈天宝，李 冰,胡学玲,曹建彪(北京军区总医院肝病治疗中心,北京 100700)



·论 著·

两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒RNA检测效果的比较及应用评价

范公忍,陈天宝，李 冰,胡学玲,曹建彪(北京军区总医院肝病治疗中心,北京 100700)

目的 比较两种核酸提取方法对实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA病毒载量的影响。 方法 选择89例2012年10月至2013年6月在肝病中心住院的慢性丙型肝炎抗-HCV阳性患者，分别用磁珠法和TRIZOL法提取血清标本中HCV RNA，用FQ-PCR技术检测HCV RNA,并对结果进行对比分析，统计学处理采用χ2检验和t检验。 结果 89例抗HCV阳性标本中以磁珠法提取核酸进行HCV RNA定量检测的阳性率为73.0%(65/89)，以TRIZOL法提取核酸进行HCV RNA定量检测的阳性率为65.1%(58/89)，两法提取方法检测阳性率比较有统计学意义(χ2=3.76，P<0.05)。两法所测浓度结果换算成对数值，经t检验两者差异无统计学意义(t=0.32，P>0.05)。结论 两种方法均可获得较高的回收率、有较高的敏感度和特异度，磁珠法提取HCV RNA可用于HCV感染者的临床诊断和疗效观察。

丙型肝炎； 核酸提取； 荧光定量聚合酶链反应； 灵敏度

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种隐匿性、持续性、进展性疾病。在我国每年新发丙型肝炎病例约为3.5万例，部分患者晚期可发展为肝硬化或肝细胞癌[1]。因此，及早发现并给予有效的抗病毒治疗是丙型肝炎现症患者治疗的关键措施。血清HCV RNA实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测可以反映HCV感染者病毒复制情况，对于HCV患者临床用药、疗效监测及预后判断均具有重要的意义[2]。定量PCR检测结果的准确性与核酸的提取方法不同而有较大差别，不同的核酸提取方法会直接影响PCR扩增效果和检测准确性[3]。因此，迫切需要一种快速、可靠的核酸提取方法以满足临床诊断与治疗的需求。本研究分别采用磁珠法和TRIZOL法提取89例抗-HCV阳性的临床患者血清中HCV RNA，FQ-PCR法测定标本中HCV RNA载量，比较两种提取方法检测结果的一致性、灵敏度和相关性，观察其临床应用效果，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年10月至2013年6月本院肝病中心住院诊断确诊为慢性丙型肝炎患者血清共89例，其中男33例，女56例，年龄25～78岁,中位年龄42岁。所有患者均符合中华医学会修订的《丙型肝炎防治指南》诊断标准[4]。治疗前采用化学发光法检测抗HCV均阳性，并排除甲、乙、丁、戊型肝炎病毒感染者。所有观察病例均清晨空腹抽取静脉血3 mL,离心后分离血清转移至无菌冻存管，-80 ℃冰箱保存，统一检测。

1.2 试剂与仪器 磁珠法提取试剂由上海之江生物科技有限公司提供(批号20121001)；TRIZOL法提取试剂由天根生化(北京)科技有限公司提供(批号20130505)；HCV RNA定量试剂由上海之江生物科技有限公司提供(批号20121001)，试剂盒最低检测限为HCV RNA≥5.00×102copy/mL为阳性；质控品为卫生部临床检验中心提供的HCV定量标准品(批号20061221)；仪器为德国Roche诊断有限公司LightcyclerTM荧光定量PCR仪，使用美国Beckman公司Microfgezzr高速冷冻离心机和Eppendorf微量加样器。

1.3 实验方法

1.3.1 磁珠法提取HCV RNA (1)磁珠与标本亲和：将50 μL待检血清加入150 μL样品结合液充分混匀后，漩涡振荡10 s，使磁珠均匀分散至缓冲液中，完全裂解病毒外壳膜蛋白，并使裸露RNA与磁珠结合，静置10 min。(2)分离磁珠：吸取分离液300 μL于结合柱中，混匀，静置3 min后，13 000×g离心40 s，弃去收集管废液。(3)洗涤磁珠:各取200 μL洗涤液A和洗涤液W于样品管中，13 000×g离心15 s洗涤1次，弃去废液。(4)解离收集RNA:将亲和柱放入1.5 mL无RNAnase离心管中加入65 ℃预热洗脱液，静置2 min后，13 000×g离心2 min，RNA被洗脱于离心管中，混匀后取5 μL作为PCR反应模板。

1.3.2 TRIZOL法提取HCV RNA 将50 μL待检血清加入150 μL Trizol溶液旋涡混匀，再加入50 μL氯仿(-20 ℃预冷)震荡混匀后，13 000×g离心10 min，吸取上清液于另一离心管中，加入与上清等量的异丙醇(-20 ℃预冷)，混匀后室温下静置10 min，然后13 000×g离心15 min，弃去上清液，加入300 μL 75%乙醇(-20 ℃预冷),混匀后，1 3000×g 离心10 min，吸干上清液，空气干燥5 min，然后加入20 μL无RNA酶水溶解混匀，取5 μL作为PCR反应模板。

1.3.3 HCV RNA定量试验 两种方法提取的核酸模板均采用上海之江生物科技有限公司提供的HCV RNA定量试剂进行平行检测,每次操作均设阴、阳对照及室内质控。PCR扩增反应条件：反转录程序42 ℃ 30 min，然后按照94 ℃ 2 min,93 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s，40个循环扩增，72 ℃ 5 min延伸。扩增结束时，仪器根据标准曲线自动给出检测结果数值。

1.3.4 敏感度比较 将已知HCV RNA强阳性质控品(5.0×107copy/mL)血清1份,用10%小牛血清按10倍梯度系列稀释,获得数个浓度的系列稀释血清，分别用上述两种方法提取稀释后标本中的总HCV RNA，经PCR扩增后，根据检测到的最低值确定两种方法的敏感度和线性关系。

1.3.5 重复性比较 取上述中等载量的HCV RNA标本1份，分别用上述两种方法各提取HCV RNA 5次，进行荧光定量PCR检测，定量结果换算成对数值，计算两种方法的批内变异系数[CV(%)]，比较两种方法提取标本测定结果的重复性。

1.4 统计学处理 用SPSS17.0统计软件和Excel软件对结果进行统计学分析，PCR检测血清HCV RNA结果以10为底数转换成对数形式计算比较，组间比较采用配对t检验，率的比较采用χ2检验；两种方法指标间相关性程度检测采用Pearson关联性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种提取方法HCV RNA浓度和纯度比较 将磁珠法和TRIZOL法所制备的总HCV RNA，加入TE缓冲液50 μL,用紫外分光光度仪测定浓度和纯度(A260/280比值为1.8～2.0)。取5 μL提纯总mRNA标本将0.8%甲醇固定后琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见28s和18s两个亚基，与标准mRNA质控品对照电泳图位置一致(图1)。结果证实磁珠法和TRIZOL法提纯的RNA模板纯度较好，在提取过程中未丢失、污染或降解。

注：1～3泳道磁珠法；4～6泳道TRIZOL法；M:质控品对照。

图1 HCV RNA纯度琼脂糖电泳图谱

2.2 临床标本结果比较 分别用两种核酸提取方法检测临床抗HCV阳性患者血清89例，其中磁珠法阳性率73.0%(65/89)，对数平均值(5.37±1.62)copy/mL；TRIZOL法阳性率65.1%(58/89)，对数平均值(5.15±1.80)copy/mL。结果显示磁珠法提取核酸标本的检测结果高于TRIZOL法，差异有统计学意义(χ2=3.76，P<0.05)。两法检测结果取对数值作图显示具有较好的相关性(r=0.925)，见图2。

图2 磁珠法与TRIZOL法检测HCV RNA结果比较

方法原浓度10-110-210-310-410-510-610-7磁珠法7．146．105．274．123．803．152．782．52TRIZOL法6．975．925．444．954．483．973．49-

注：-表示低于最低检测限。

图3 两种提取方法检测HCV RNA敏感度比较

2.3 敏感度比较 磁珠法最低检测限为10-7copy/mL，TRIZOL法最低检测限为10-6copy/mL水平，两者比较磁珠法敏感度略高于TRIZOL法，对于测定值在10-4以下的低浓度HCV RNA标本，磁珠法提取核酸检测下线更灵敏；将两法所测浓度结果换算成对数值，两种核酸提取方法检测结果的敏感度比较差异无统计学意义(t=0.32，P>0.05)(图3)。

2.4 重复性比较 用磁珠法提取核酸标本检测HCV RNA的结果优于TRIZOL法(表2)。

表2 两种核酸提取方法检测HCV RNA的重复性比较

3 讨 论

病毒核酸检测技术中核酸提取是最重要的环节之一，由于HCV为单股正链线状RNA病毒，其基因组具有高度的多态性和变异性，容易受到RNA酶的破坏而降解[5]。因此，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染。HCV RNA扩增过程需要将mRNA反转录为cDNA，其中转录酶活性及模板的得率多少均影响定量结果的准确度[6-7]。目前由于国内HCV定量检测核酸提取纯化方法不标准，且参与扩增模板标本量少(5 μL)及反应体系量不足(20～40 μL)；扩增过程中没有内标作参考，缺乏对假阴性结果的监控，导致各医疗单位检测结果无法参考比较[8]。因此，选择质量好且符合自己试验要求，并与本实验室仪器相配备的试剂，对于保障试验结果的准确度非常重要。

本研究分别采用磁珠法和TRIZOL法提取89例抗-HCV阳性患者血清中HCV RNA，为保证试验结果的可比性，试验设计除核酸提取方法不同外，其余操作过程、模板上样量及扩增试剂均相同，并在同一扩增仪上同时检测。结果显示磁珠法核酸检测结果阳性率为73.0%(65/89)，TRIZOL法阳性率为65.1%(58/89)。结果表明这两种核酸提取方法均可以通过提纯获得较好的核酸模板，在相同的检测条件下，检测结果敏感度相近，都能满足临床需要，磁珠法检测结果略优于TRIZOL法。磁珠法是利用磁球颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合与解离的原理，尽可能地避免了提取过程中核酸的丢失，还能很好地去除标本中可能存在的干扰物质(如血红蛋白，胆红素及高血脂等因素)影响，使核酸模板得到较好的纯化[9]，尤其对临界值附近的低浓度HCV标本提取效果更好，磁珠法比TRIZOL法提取的标本检测限更低，敏感度更好；用磁珠法处理标本所得定量结果能更好地反映出标本之间的倍比稀释关系。TRIZOL法操作步骤繁琐，需将液体多次转移、容易造成核酸的丢失，加之本研究应用的是国产TRIZOL试剂，可能与进口试剂之间也存在着差异。这可能是TRIZOL法提取的标本在扩增效率、敏感度和重复性等方面略低于磁珠法的原因。钟海军等[10]曾报道比较了不同核酸提取HCV RNA的效果，结果显示磁珠法提取的核酸标本具有较好的扩增效率，线性关系和可重复性均高于常规的酚-氯仿提取法。本文检测结果进一步证实了磁珠法提取核酸纯度高、检测结果准确度好的优点，但还需要扩大标本量进行深入的研究。

干扰素(IFN-α)是目前临床抗HCV治疗的首选药物。随着治疗时间的延长，大部分患者血清中HCV RNA载量检测报告“低于最低检测限”水平。但这部分患者并非真正意义上的病毒完全清除，而是由于病毒提取方法的缺陷或仪器检测灵敏度不够，不能检测出尚存的低载量HCV RNA所致[11]。因此，必须重视低载量HCV RNA标本的提取与检测，保障临床检测结果报告的准确度，使肝细胞癌患者尽可能达到理想的治疗目标，为调整用药剂量及治疗时间，制订个体化的治疗方案提供指导[12]。

本研究结果显示，磁珠法是一种操作简便、纯化效率高的提取方法，可应用于HCV感染者的临床诊断和疗效监测，尤其在HCV RNA载量处于低浓度水平时，该方法可将全部核酸标本参与到PCR反应过程中，最大限度地减少了核酸丢失，结果敏感度高、准确度好，对于检测慢性丙型肝炎患者血清中低载量HCV RNA水平比TRIZOL法具有更好的应用前景。

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Comparison of effects between two kinds of nucleic acid extraction method for detecting HCV RNA and their application evaluation

FANGong-ren,CHENTian-bao,LIBing,HUXue-ling,CAOJian-biao

(TherapyCenterforLiverDiseases,GeneralHospitalofBeijingMilitaryRegion，Beijing,100700,China)

Objective To compare the influences of two kinds of nucleic acid extraction method for detecting hepatitis C virus(HCV) RNA viral load by the real-time fluorescenct quantitative(FQ) PCR.Methods 89 inpatients with chronic hepatitis C(CHC) and anti-HCV positive in the Therapy Center for Liver Diseases of our hospital from October 2012 to June 2013 were selected and HCVRNA was extracted from the serum specimens by using the magnetic beads and Trizol methods.FQ-PCR was adopted for detecting serum HCV RNA.The detected results were performed the comparative analysis.The statistic processing adopted the χ2test andttest.Results The positive rate of serum HCV RNA extracted by the magnetic beads and Trizol methods were 73.0%(65/89) and 65.1%(58/89) respectively,and the difference between the two methods showed the statistical significance(χ2=3.76,P<0.05).By converting the concentration results detected by these two methods into the log values,there was no statistically significant difference between the two methods(t=0.32,P>0.05).Conclusion The two kinds of method can obtain the higher recovery rate with higher sensitivity and higher specificity.The magnetic beads method for extracting HCV RNA could be used in the clinical diagnosis and therapeutic observation in the HCV infected persons.

hepatitis,C; nucleic acid extraction; fluorescent quantitative PCR; sensitivity

范公忍，男，副主任技师，大学本科/医学学士，主要从事慢性肝病发病机制和临床诊治研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.018

A

1672-9455(2015)01-0048-03

2014-03-16

2014-08-02)