微量肉汤稀释法检测中药香囊挥发油对5种呼吸道致病菌抗菌作用*

陈奕雯,陈 华,许爱萍(湖北省武汉市中医医院检验科 430014)



·临床研究·

微量肉汤稀释法检测中药香囊挥发油对5种呼吸道致病菌抗菌作用*

陈奕雯,陈 华△,许爱萍(湖北省武汉市中医医院检验科 430014)

目的 探讨中药香囊提取挥发油在体外对5种呼吸道常见致病菌的抗菌作用。 方法 采用微量肉汤稀释法测定中药香囊挥发油对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌标准菌株的最小抑菌浓度值和临床分离菌株最小抑菌浓度范围。结果 挥发油对以上5种菌标准菌株最低抑菌浓度值分别为小于或等于0.000 15、0.000 125、0.001 25、0.001 45、>0.08，对临床分离菌最低抑菌浓度范围分别为小于或等于0.000 15、0.000 25～0.000 145、0.002 5～0.000 625、0.002 5～0.001 25、>0.08。结论 除铜绿假单胞菌外，中药香囊挥发油对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌均有较好的抗菌效果。

中药香囊挥发油； 体外抗菌作用； 微量肉汤稀释法

呼吸道感染是人类最常见的传染病之一，预防和治疗呼吸道感染一直是全球关注的热点，现代中医通过状态调治以消除异常病理状态，恢复正常健康状态，这种在长期医学实践中形成的独具特色的医学体系，在治未病方面有潜在的优势[1-3]。本院将广藿香、丁香、檀香等具有抑菌作用和薄荷脑、艾叶等有祛风散寒作用的药材制作成中药香囊，通过让患者长期佩戴改善患者基础健康状态，同时通过抑制人体的潜在病原体过度繁殖达到预防呼吸道感染、治未病的作用。本实验参照美国标准化委员会的药敏执行标准M45-A2、M07-A8、M100-S20对本院中药香囊挥发油进行药敏测试，研究其抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 试验临床菌株来源与鉴定 选用的临床菌株有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌各20株。它们均来自本院门诊及病房送检的呼吸道标本中分离并经过BD-phenix100全自动微生物分析仪鉴定及药敏试验，将其纯培养后存于30%甘油肉汤管或脱脂牛奶管中-20 ℃冰箱备用。

1.2 标准菌株 ATCC29213金黄色葡萄球菌、ATCC25922大肠埃希菌、ATCC49619肺炎链球菌、ATCC27853铜绿假单孢菌、ATCC700603肺炎克雷伯菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.3 中药材 艾叶200 g、白豆蔻200 g、丁香60 g、檀香100 g、山奈200 g、小茴香100 g、苍术100 g、广藿香150 g、 薄荷脑50 g、肉桂60 g，由武汉市中医医院药学基地提供，取各中药的药材，适当粉碎，按2010版《中国药典》[4]附录XD的方法提取挥发油，经无水硫酸钠脱水加入挥发油融化，密封保存，备用。

1.4 试剂及培养基 十二烷基硫酸钠(分析纯)，武汉医药公司进口分装；生理盐水(0.9%氯化钠注射液)，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，产品批号：121004907； MHB肉汤培养基，购自杭州天和微生物试剂公司；MHA营养琼脂培养基，购自杭州天和微生物试剂公司；脱干冻纤维羊血，购自杭州天和微生物试剂公司。

1.5 仪器与设备 中草药粉碎机、挥发油提取装置、HH-S型水浴锅、超净工作台、电热蒸气消毒器、手动(可调试)移液枪、96孔灭菌酶标板购自美国Costar公司、恒温培养箱、电子天平、冰箱、超纯水制造系统等。

1.6 实验分组 参照美国国家临床实验室标准化委员会M45-A2《苛养菌的稀释法抗菌药物敏感试验参考方法》[3]； M07-A8《需氧菌的稀释法抗菌药物敏感试验参考方法》[3]；M100-S20《抗菌药物敏感性试验执行标准》[3]对中药香囊挥发油进行最低抑菌浓度检测,分为标准菌株组和临床分离组。标准菌株组：测试挥发油乳液对5种呼吸道细菌标准菌株(模式种)的MIC值，保证实验浓度和结果的可行性。临床分离组：测试挥发油乳液对临床呼吸道标本分离的不同耐药性菌株的MIC值，评价挥发油体外抗菌的效果。

1.7 方法

1.7.1 挥发油乳液存储液的制备 取十二烷基硫酸钠0.1 g，加生理盐水100 mL溶解，制成0.1%十二烷基硫酸钠溶液；取溶液21 mL，加中药香囊挥发油原液4 mL,搅拌使其充分乳化，挥发油乳液储存液浓度为最高试验浓度的10倍，即0.16 U·mL-1。

1.7.2 微量挥发油药敏板的制备 取无菌96孔酶标板,在每列第1孔加入0.1%十二烷基硫酸钠溶液50 μL为阴性对照，第2孔只加入菌液为阳性对照，第3孔加入中药香囊挥发油原液100 μL,第4～12孔 加0.1%十二烷基硫酸钠溶液50 μL。 从第3孔吸取50 μL药液加入第4孔,充分混匀后吸取50 μL加入第5孔,依次做倍比稀释至第12孔,第12孔的药液混匀后吸取50 μL弃去。配置好的药敏板每列为一株受试菌的梯度，从第3孔至第12孔加入菌液后最终药物浓度由高到低为0.08～0.001 56 U·mL-1。

1.7.3 试验菌株和标准菌株菌液的制备 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌的试验菌株和标准菌株用无菌接种环从脱脂牛奶管或30%甘油肉汤管中刮取菌液到血平板，35 ℃、5%CO2环境中培养18～24 h后，从血平板中挑选2～3个菌落在生理盐水中制成0.5麦氏单位悬液，其浓度是(1～2)×108cfu·mL-1。

1.7.4 试验菌株和标准菌株接种

1.7.4.1 将肺炎链球菌外的试验菌株和标准菌株0.5麦氏单位悬液取50 μL加入5 mL的MHB肉汤培养基中制成接种液，取已加入挥发油乳液的96孔酶标板每株菌接种一行2～12孔接种50 μL，使其最终试验菌每孔浓度大约是5×105cfu·mL-1，放35 ℃环境中培养24 h。

1.7.4.2 肺炎链球菌的试验菌株和标准菌株0.5麦氏单位悬液取50 μL加入5 mL的MHB肉汤+5%脱脂纤维羊血培养基中制成0.5麦氏单位悬液，取已加入挥发油乳液的96孔酶标板每株菌接种一行2～12孔接种50 μL，其最终试验菌每孔浓度大约是5×105cfu·mL-1，放35 ℃、5%CO2环境中培养24 h。

1.7.5 最低抑菌浓度(MIC)值判读 肉眼观察培养液澄清的为阴性(即无细菌生长)，培养液混浊的为阳性(即有细菌生长)。并且用多点接种装置接种到血平板培养24 h，观察有无菌落生长以验证是否无菌生长。

2 结 果

2.1 标准菌株组结果 香囊挥发油对5种实验标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠埃希菌ATCC25922、肺炎链球菌ATCC49619、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603)的MIC值检测结果见表1。除铜绿假单胞菌外，香囊挥发油对试验菌株的标准菌株均有抑制效果，实验的挥发油浓度范围合理，实验可以继续进行。

2.2 临床分离组结果 香囊挥发油对20株临床分离得到肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌抑制率分别为100%、90%、95%、60%(MIC范围分别为(MIC≤0.000 15、0.002 5～0.000 625、0.002 5～0.001 25、0.000 25～0.000 145)，对20株临床分离的铜绿假单胞菌无抑制效果(MIC>0.08)，结果见表2、3。

表1 中药香囊挥发油对5种标准菌株的抑菌效果

注：+为细菌为生长，-为无细菌生长。

表2 中药香囊挥发油对临床分离的试验菌株的抑菌效果

注：+为细菌为生长，-为无细菌生长。

表3 不同浓度的中药香囊挥发油对5种不同细菌的耐药菌株数量

3 讨 论

呼吸道感染多发于冬春季节，散发，且可在气候突变时小规模流行。呼吸道感染20%～30%为细菌引起，可单纯发生或继发于病毒感染之后，以肺炎链球菌、葡萄球菌等口腔定植菌多见，也常见肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等革兰阴性菌，但接触病原体后是否发病，取决于传播途径和人群易感性。淋雨、受凉、气候突变、过度劳累等可降低呼吸道局部防御功能，使原携带的病毒或细菌迅速繁殖，同时作为一些易感人群，老年、体弱免疫功能低下或有慢性呼吸道疾病者更易发病[4]。传统的处理措施是在出现呼吸道症状后予以药物治疗，但往往因已过细菌潜伏期，发病时间较长使得应用抗菌药物事倍功半，对于年老、体弱等免疫力低下人群更是危害性较大。寻求一种安全、简便的方法进行有效地预防呼吸道疾病发生，使在治未病方面取得良好的效果，是目前老年化社会亟待解决的一个医学问题。

目前已有较多研究证明中药对细菌或耐药菌有良好的抗菌作用[5]。文献报道广藿香水提物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎球菌、产气杆菌有明显抑制效应[6]。中药丁香具有较强的抗菌消炎作用，张军锋等[7]报道丁香对金黄色葡萄球菌、肠炎球菌、肺炎链球菌、痢疾杆菌、铜绿假单胞菌等具有明显的抗菌作用，同时还具有明显的镇咳、祛痰作用，因而对呼吸道感染具有良好的防治作用。而檀香具有良好的抗菌和抗氧化成分，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用[8]。由此可见,以上3种中药对常见的呼吸道细菌均有良好的抑制作用,因此本院将广藿香、丁香、檀香3种具有抑菌效果的中药和薄荷脑、艾叶等有祛风散寒作用的药材制作成中药香囊，研究其抗菌活性，以期对免疫功能低下等特殊人群起着良好的治未病功效。

本实验中本院中药香囊的挥发油对常见呼吸道致病菌有较好的抑制效果，特别是社区人群容易感染的肺炎链球菌，本实验中20株临床分离菌在MIC≤0.00015的浓度，可全部抑制，对其他常见菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌也有较好的抑制效果，抑制率分别达到90%、95%、60%，如果患者在日常生活中长期佩戴中药香囊，能对人体携带的潜在的呼吸道致病菌(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌)有一定抑制作用，控制了潜在致病菌的过度繁殖，能达到防治呼吸道感染的效果。此次实验中中药香囊挥发油对铜绿假单胞菌没有抑菌效果，这和既往文献报道有所矛盾，分析其原因可能是由于选取适应其他4种致病菌的挥发油浓度不足以抑制铜绿假单胞菌，并且铜绿假单胞菌的耐药基因多，机制较复杂，因此几种抗菌药物如何进行合适比例的配伍以发挥更好的疗效是未来进一步研究的方向。

[1]张志巧,夏以琳.中医药防治小儿反复呼吸道感染的研究进展[J].四川中医,2012,30(3):56-59.

[2]赵童童,王建玲,舒兰.小儿反复呼吸道感染的中医治疗研究进展[J].中医药导报,2012,18(1):76-78.

[3]李小鹏,王治国.美国临床实验室标准化委员会标准与指南[J].中华检验医学杂志,2001,24(4):251-252.

[4]王挺.老年呼吸道感染患者病原性细菌分析[J].中国卫生产业,2014,22(9):155-156.

[5]范虹,李彦锋.国产微量肉汤稀释法药敏试剂检测常见多重耐药菌[J].国际检验医学杂志,2013,34(20):2735.

[6]罗超坤.广藿香水提物的抗菌实验研究[J].中药材，2005,28(8):700-701.

[7]张军锋,张树军.丁香属植物的化学成分及其药理作用的研究进展[J].海南大学学报：自然科学版，2007,25(2):200-205.

[8]黄娟娟,杨艳,林奕云,等.檀香叶提取物抗氧化及抗菌活性初步研究[J].食品工业科技,2012,33(9):13-130.

湖北省武汉市卫生局临床医学科研项目(WZ11B02)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.033

A

1672-9455(2015)01-0085-02

2014-04-22

2014-09-10)

△通讯作者，E-mail:769491105@qq.com。