时间分辨荧光法检测乙型肝炎病毒血清标志物的检出限探讨

秦 雯,胡大春,肖利华(昆明市第一人民医院检验科 650011)



·论 著·

时间分辨荧光法检测乙型肝炎病毒血清标志物的检出限探讨

秦 雯,胡大春,肖利华(昆明市第一人民医院检验科 650011)

目的 确立时间分辨荧光方法检测血清乙型肝炎病毒(乙肝)表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(HBeAb)以及乙肝核心抗体(HBcAb)(俗称乙肝两对半)的检出限(LOD),以指导其检测结果的合理解释与应用。方法 参考美国临床检验标准化委员会(CLSI)EP17-A文件提供的方案和相关文献，建立实验室时间分辨荧光分析仪检测血清乙肝两对半的空白限(LOB)及LOD。结果 时间分辨荧光分析仪检测血清乙肝两对半中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB分别为0.042 5 ng/mL、0.500 5 mIU/mL、0.000 PEIU/mL、0.997 DRU/mL、0.091 DRU/mL；LOD分别为0.163 ng/mL、1.203 mIU/mL、0.401 PEIU/mL、1.756 DRU/mL、0.350 DRU/mL。结论 时间分辨荧光方法检测血清乙肝两对半，均有较低的检出限，可较敏感地检出血清乙肝两对半中的各项抗原及抗体，早期指导临床对乙型肝炎病毒感染的诊断、疗效的观察及预后的判断。

乙型肝炎病毒； 乙型肝炎病毒标志物； 时间分辨荧光方法

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)感染是全球的公共卫生问题，估计全世界HBV携带者达3.5亿人之多，我国人口携带率约为1.2亿。乙肝的诊断依赖于对其标志物的检测，血清乙肝两对半[乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(HBeAb)以及乙肝核心抗体(HBcAb)]传统的筛查方法是酶联免疫吸附法，该方法对血清HBsAg的检测灵敏度为2 ng/mL[1]，低于2 ng/mL的低浓度标本检测结果表观表现为阴性。慢性乙型肝炎患者中由于抗体缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答使得HBV相应标志物浓度较低，HBV感染早期等病毒含量较低，酶联免疫吸附法有可能检测不到，表观表现为乙肝两对半阴性。文献报道时间分辨荧光免疫技术检测HBsAg灵敏度可达0.2 ng/mL，能提高HBV感染的诊断率并缩短检测窗口期[2]。近年来美国临床检验标准化委员会(CLSI)对检测方法的灵敏度提出了新的概念[3]，分别采用空白限(LOB)、检出限(LOD)、测定限(LOQ)从不同的层面表述方法的检测灵敏度，对于定性报告的检测方法，LOD的确定尤其重要。本文对时间分辨荧光法检测血清乙肝两对半的检出限进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与设备 时间分辨荧光法乙肝两对半诊断试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，为同一批号试剂。UranusAE100全自动酶联免疫检测仪为爱康公司产品、时间分辨荧光免疫分析仪M6601为达瑞公司产品。

1.2 标本处理 空白样品：用未感染乙型肝炎的患者的阴性血清(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb均为阴性)作为空白样品，共6份，用于时间分辨荧光方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB。低浓度样品：将时间分辨荧光方法检测出HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb各项已知浓度的标本，用试剂盒中的分析缓冲液稀释为6个低浓度的标本，用于时间分辨荧光方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOD。

1.3 方法 由于试剂生产厂商对HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB未提供申明，因此本实验室选择60个数据建立LOB、60个数据建立LOD。检测时仪器状态良好，操作人员固定，熟练掌握仪器的各项操作规程，使用自制质控品，CV为17%，室内质量控制在控，按时间分辨荧光方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的操作说明书检测空白标本及低浓度标本，试剂批号为20110101C。

1.3.1 LOB 的确定 对6个空白标本用时间分辨荧光法乙肝两对半定量检测试剂在UranusAE100全自动酶联免疫检测仪上完成加样、孵育、洗板等步骤，在时间分辨荧光免疫分析仪M6601上测定荧光强度，通过标准曲线得到标本中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的浓度。每天检测2次，重复5 d检测，共得60个空白标本数据。对这60个空白标本数据进行分布检验，并根据数据分布情况选用参数或非参数方法计算LOB。空白值呈非正态分布则用非参数方法估计第95百分位数(PctB)的值[4]，即LOB=PctB100-α，即LOB=在[NB(ρ/100)+0.5]位置的结果(NB是重复检测的次数，ρ是百分位数)。

1.3.2 LOD的确定 每天按照理论浓度稀释为6个低浓度的稀释标本，稀释后用与空白标本检测相同的程序对这6个低浓度标本进行检测，每个浓度重复2次检测，共检测5 d，共得60个低浓度标本数据。对这60个数据进行分布检验，并根据分布情况选用参数或非参数方法计算LOD。检测过程中，为使检测标本的基质相同，在对HBsAg低浓度标本进行稀释时使用相同的分析缓冲液，且不选用有溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的标本，以便排除可能的干扰。

低浓度样品检测结果呈正态分布[5]，LOD=LOB+CβsS。计算多个低浓度样品的综合标准差(ss)：ss2=(n1s12+n2s22+n3s32……+ nmsm2)/(n1+n2+n3+……+nm) 式中n1n2……nm代表不同低浓度样品的自由度。 Cβ是标准正态分布第95百分位数值的校正因子，Cβ=1.645/(1-1/4∫)，∫是ss的自由度。

2 结 果

2.1 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb空白标本检测结果 分别检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 60个空白标本，对检测得到的60个空白标本数据作升序排列，显示空白标本检测数据结果呈偏态分布，故使用公式LOB= PctB100-α，LOB在[NB(ρ/100)+0.5]位置的结果。其中NB为60，ρ为95%，LOB=[60(95/100)+0.5]=57.5，即第57、58位数的中间值。故HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb使用上述公式计算的LOB结果分别为0.042 5 ng/mL、0.500 5 mIU/mL、0.000 PEIU/mL、0.997 DRU/mL、0.091 DRU/mL。

表1 乙肝两对半的理想稀释浓度(ng/mL)

2.2 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低浓度标本检测数据结果见表1。HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb乙肝两对半各组稀释浓度标本标准差及LOD如表2所示。

表2 乙肝两对半各组稀释浓度标本标准差及LOD(ng/mL)

3 讨 论

时间分辨荧光方法采用镧系元素作为标记物，镧系元素螯合物的荧光寿命较长(10～1000 μs)，背景荧光寿命较短，可有效地降低本底荧光的干扰；镧系元素的荧光stokes位移较大，可使激发光与发射光分开，消除激发光的散射干扰；镧系元素发射光谱较窄,多在(613±10)nm，(615±5)nm的滤光片只允许此波段荧光通过，减少了来自生物样品荧光的干扰，有效降低了本底荧光，激发光谱较宽有利于增加激发能，故检测灵敏度较高[6]。建立时间分辨荧光方法检测乙肝两对半的检测灵敏度对指导其结果的合理解释及应用有重要意义，有关文献报道时间分辨荧光方法检测乙肝两对半的灵敏度为0.2 ng/mL，但具体的检测灵敏度方法不明确[1]。2004年美国临床检验标准化协会发布了EP17-A文件，即“检出限和定量检出限确定方案-批准指南”[5]，该方案推荐使用LOB、LOD和LOQ来表示检测系统或方法的灵敏度性能。可直接把分析仪输出的浓度或质量单位结果用于估计限值，不以数据是否为正态分布为前提，以检验的允许误差来估计定量限值，充分保证了检测结果即使在低值条件下也能符合临床需求的质量管理要求[6]。

参照EP17-A文件提供的方案及CNAS-C130 的要求，本文对时间分辨荧光方法检测乙肝两对半的LOB 和LOD进行检测。LOB是指在规定的可能性条件下，空白样品被观察到的最大检测结果。LOB不是检测到的实际浓度，是确保在实际浓度处的阳性信号成为检出限，是含有分析物等于LOD水平的样品预期得到的最低值；这和“检测下限”相同，由规定的测量程序得到，可以给出一定测量不确定度的最低检测结果，也称为“临界值”[7]。本文参照该方案确立的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB分别为0.042 5 ng/mL、0.500 5 mIU/mL、0.000 PEIU/mL、0.997 DRU/mL和0.091 DRU/mL，与黄永富等[8]的检测结果基本一致，说明并不是所有的空白标本都没有信号输出，可能会有很少许本底荧光的干扰或其他因素的影响。

LOD是指标本中分析物的最小量，可以在规定的可能性条件下予以检出，但也许还不能量化为一个确切的值。也被称为“检测下限”、“最小的可检测浓度”，有时也用于指示“灵敏度”。LOD是这个样品的实际浓度，它是可靠检测到的最低实际浓度。本文参照该方案确立的HBsAg最低LOD为0.163 ng/mL，较上述文献报道的检测灵敏度为0.2 ng/mL低，较试剂说明书给出的HBsAg最低检出量adr亚型为0.2 ng/mL、adw亚型为0.5 ng/mL；ay亚型为0.5 ng/mL均低，证实时间分辨荧光方法能较为敏感的检出血清中的HBsAg，只要在此检出限以上的结果均说明血清中的HBsAg是有一定含量的，能较好地检测出灰区标本，可在一定程度上减少漏诊率，避免误诊。HBsAb最低LOD为1.203 mIU/mL，较试剂说明书给出的HBsAb最低检出量应不高于5 mIU/mL为低,HBeAg、HBeAb、HBcAb最低LOD分别为0.401 PEIU/mL、1.756 DRU/mL、0.350 DRU/mL，均较试剂说明书给出的最低检出量为低,可能因不同的TRFIA 检测系统所用设备、标记物、分析原理等均不相同，且缺乏参考方法，以及工作人员对仪器的操作、试验标本存在差异的原因。由此可见乙肝两对半定量检测较定性检测更敏感，在HBV标志物处于低浓度时，定性检测可表现为阴性，而定量检测仍可检出，检测到的最低实际浓度即检测限则能较好地帮助临床诊断是否感染了乙肝，决定治疗方案，因此确定检测限就显得尤为重要。同时可提高乙肝诊断率并缩短检测窗口期，合理指导时间分辨荧光方法检测乙肝两对半结果的解释，真正指导临床对乙肝的诊断、疗效的观察及预后的判断，对乙肝的早期诊断、预防接种方面有重要的临床意义。但如果要为临床诊断乙肝提供更为准确、完整的报告，还必须确立HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的定量LOQ，这将在下一步的工作中完成。

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[3]NCCLS.EP17-A.Prolcols for derermination of delection and limits of quantitation;approved guideline[S].Wayne，PA：NCCLS，2004：1-39.

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Study on TRFIA for detecting detection limit of hepatitis B virus serological markers

QINWen,HUDa-chun,XIAOLi-hua

(DepartmentofClinicalLaboratory,KunmingMunicipalFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650011,China)

Objective To establish the limit of detection(LOD) of hepatitis B surface antigen(HBsAg),HbsAb,HbeAg,HbeAB and HBcAB by using the time-resolved fluorescence immunoassy(TRFIA) in order to guide the reasonable interpretation and application for their detection results.Methods Referring to the scheme and the related literature provided by the EP17-A document of CLSI,the limit of blank(LOB) and the limit of detection(LOD) of the hepatitis B serological markers by using TRFIA were established.Results LOB of serum HBsAg,HbsAb,HbeAg,HbeAb and HBcAb was 0.042 5 ng/mL,0.500 5 mIU/mL,0.000 PEIU/mL,0.997 DRU/mL and 0.091 DRU/mL respectively；LOD was 0.163 ng/mL,1.203 mIU/mL,0.401 PEIU/mL,1.756 DRU/mL and 0.350 DRU/mL respectively.Conclusion TRFIA for detecting serum hepatitis B serological markers has the lower LOD,can more sensitively detect each antigen and each antibody of hepatitis B serological markers and early guide clinical diagnosis of hepatitis B virus infection,efficacy observation and prognosis judgment.

hepatitis B virus; hepatitis B virus markers; TRFIA

秦雯，女，主任技师，学士/本科，研究方向是临床免疫学检验。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.013

A

1672-9455(2015)01-0034-03

2014-03-22

2014-08-15)