丙型肝炎病毒基因型与慢性丙型肝炎患者病情严重程度之间关系的研究*

乔 斌，汪 明，袁乐永，熊 格，李 艳(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)



·论 著·

丙型肝炎病毒基因型与慢性丙型肝炎患者病情严重程度之间关系的研究*

乔 斌，汪 明，袁乐永，熊 格，李 艳△(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)

目的 分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型与慢性丙型肝炎患者病情严重程度之间关系，为慢性丙型肝炎患者的临床诊断和治疗提供依据。方法 采用直接测序法对HCV进行基因分型，并测量患者未治疗前HCV-RNA水平、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、清蛋白(ALB)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)水平。结果 共对321株HCV进行基因分型，其中1a型占1.2%，1b型占78.5%，2a型占8.7%，3a型占2.2%，3b型占4.7%，6a型占2.8%，6b型占1.9%。HCV1型患者ALT、HCV-RNA、AST/PLT比值指数(APRI)水平明显高于非1型患者，差异有统计学意义(P值分别为0.009，<0.01，0.036)；而AST、ALB、Hb、PLT、AST/ALT水平两者并无明显差异。结论 HCV1型患者HCV-RNA水平高于非1型患者，肝脏功能损害较非1型患者严重。

丙型肝炎病毒； 基因型； 丙氨酸氨基转移酶； 天门冬氨酸氨基转移酶； 血小板计数

丙型肝炎是一种呈全球性分布的传染性疾病，2012年WHO统计大约有1.5亿人感染丙型肝炎病毒(HCV)，其中75%～85%发展为慢性感染，每年有超过35万人死于HCV感染相关的肝脏疾病[1-2]。我国慢性丙型肝炎感染患者大约有(2 000～5 000)万，约占世界所有丙型肝炎患者的15%～30%[3]。研究发现，不同基因型的HCV感染患者病情严重程度有所差异。本文对慢性丙型肝炎感染患者的病毒基因型及相关指标进行检测分析，为慢性丙型肝炎患者的临床诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择2011～2013年武汉大学人民医院收治的321例慢性丙型肝炎初治患者，其中男180例，平均年龄(43.96±18.44)岁；女141例，平均年龄(50.77±12.20)岁。慢性丙型肝炎的诊断符合2004年《丙型肝炎防治指南》中的诊断标准[4]，所有纳入患者入院之前均无系统的接受抗病毒治疗，并且无其他疾病。

1.2 检测方法

1.2.1 HCV基因分型检测 HCV-RNA提取采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血浆TRIzol LS提取法，提取后的RNA使用Thermo公司的RevertAid®第一链cDNA Synthesis试剂盒进行反转录，反转录引物为随机引物；测序引物forward primer 5′-TTA ACC ACA TCM RCT CCG TGT G-3′,reverse primer 5′-GTA CCT GGT CAT AGC YTC CGT RAA-3′，采用ABI公司3130XL测序仪检测。测序结果与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)上的参考序列AF009606、AF271632和AF139594等进行比对分析，确定HCV基因型。

1.2.2 HCV-RNA定量检测 HCV-RNA提取采用凯杰公司的QIAcube全自动核酸提取仪及配套试剂(凯杰careHCV RT-PCR Assay V1试剂盒)，使用罗氏LighterCycler480 PCR仪及凯杰careHCV RT-PCR Assay V2试剂盒进行HCV-RNA定量，线性范围为1×103～5×107；定量结果超过线性范围(>5×107)以5×107计算。

1.2.3 相关指标检测 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、清蛋白(ALB)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)水平检测通过检验科常规生化仪(Olympus AU-5400；Simens ADVIA2400)和血细胞仪(Sysmex XE-2100)测量。

2 结 果

2.1 共对321例丙型肝炎患者的HCV进行基因分型，其中1a型4例，占1.2%；1b型252例，占78.5%；2a型30例，占8.7%；3a型7例，占2.2%；3b型15例，占4.7%；6a型9例，占2.8%； 6b型6例，占1.9%。见图1。

2.2 256例HCV基因型1型患者与65例基因型非1型患者相关指标的比较 两者在AST、ALB、Hb、PLT水平上差异无统计学意义(P值分别为0.471、0.597、0.835、0.378)；在ALT、HCV-RNA、AST/PLT比值(APRI)水平差异有统计学意义(P值分别为0.009、<0.01、0.036)。见表1。

表1 HCV基因型1型与非1型相关指标的比较±s)

注：HCV-RNA定量结果以对数值计算log10(HCV-RNA)。APRI：AST/PLT比值。

图1 HCV基因型分布

3 讨 论

HCV基因组呈现高度异质性，根据HCV基因组序列的差异程度，目前可将HCV分为6个主要基因型(30%～35%)、68个基因亚型(20%～25%)及若干分离株(5%～8%)和准种(1%～5%)[5-6]。我国大部分地区主要流行的HCV基因为1b型，其次为2a型，南方城市1b基因型感染率可达到90%以上，从南向北2a基因型逐渐增多。目前为止，我国尚未发现HCV基因型4或5型感染[4]。本研究通过对321例慢性丙型肝炎HCV基因分型发现，1b型为主要感染基因型，占78.5%；其次为2a型，占8.7%；向下依次为3b型占4.7%，6a型占2.8%，3a型占2.2%，6b型占1.9%，1a型占1.2%。由于不同HCV基因型的核苷酸序列存在差异，因此HCV不同基因型在感染性、致病力、对抗病毒治疗的反应性和地区群集等方面有着明显的差异。本研究发现HCV 1型患者HCV-RNA水平明显高于非1型患者(P<0.01)，而两者的基础状态无明显差别，ALB水平、Hb水平、PLT水平均无明显差异。目前研究认为，HCV 1型病毒载量明显高于非1型患者，这可能与HCV 1型具有更强的复制能力相关[7-8]。而病毒载量又与患者的抗病毒治疗效果相关，低病毒载量常常更易获得持续性病毒应答(SVR)[9]。

肝脏代谢酶水平是反映肝脏组织损害的最灵敏指标之一，其中ALT、AST是应用最多的两个肝脏代谢酶，水平越高，肝脏组织损害程度越严重。本研究通过对HCV基因型1型和非1型患者血清ALT、AST水平进行比较分析，发现HCV基因型1型患者ALT水平明显高于非1型患者，差异有统计学意义(P=0.009)，而AST、AST/ALT水平差异无统计学意义(P值分别为0.471、0.15)。这可能由于ALT存在胞质内，肝细胞受到破坏更易进入血循环中而检测到，而AST位于线粒体内，需要进一步的破坏尚可释放入血循环，并且慢性丙型肝炎患者肝脏损伤是慢性持续性的，这也可能导致ALT水平升高明显，而AST水平升高不明显。HCV基因型1型感染与肝炎的慢性化进程和严重的肝脏疾病有关，推测这与型特异性基因编码的蛋白有较强的细胞毒作用有关。相关研究也表明，基因型1b在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中占绝大多数，同时多表现为血清ALT升高，提示易导致肝细胞损伤[10-11]。

APRI作为一个简单、非侵入性指标用来反映慢性丙型肝炎患者肝脏纤维化及肝硬化程度。研究发现，APRI>1.5，肝脏呈现严重的纤维化改变；APRI>2.0，肝脏呈现肝硬化改变[12]。本试验对发现HCV基因型1型患者APRI水平高于非1型患者，也从侧面反映出基因型1型患者肝脏损害程度更加严重。

另外，有研究表明，HCV基因型1a、2a合并HBV感染的发生率较高，大部分急性肝炎患者为基因型1a；基因型3a感染与肝脏脂肪变的关系较为密切；基因型4感染易引起失代偿性肝脏并发症[13]。因此，丙型肝炎防治指南中推荐对丙型肝炎患者治疗前，应进行HCV基因分型，评估患者的病情，为患者制订合适的治疗方案，而且可以预测治疗效果[14]。

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Relationship between HCV genotypes and severity degree of patients with hepatitis C*

QIAOBin,WANGMing,YUANLe-yong,XIONGGe,LIYan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To analyze the relationship between hepatitis C virus(HCV) genotypes and the severity degree of the patients with hepatitis C in order to provide the basis for the diagnosis and treatment of chronic hepatitis C(CHC).Methods The genotype of HCV was tested by the direct sequencing method,and the levels of HCV-RNA,ALT,AST,ALB,Hb,PLT,AST/ALT and AST to ptatelet ratio index(APRI) before treatment were determined.Results 321 strains of HCV were performed the genotyping,in which,1b,2a,3b,6a,3a,6b and 1a accounted for 78.5%,8.7%,4.7%,2.8%,2.2%,1.9% and 1.2% respectively.The levels of ALT,HCV-RNA,APRI in the patients with HCV genotype 1 were higher than those in the patients with non-genotype 1,the differences had statistical significance(P<0.01); while the levels of AST,ALB,Hb,PLT and AST/ALT had no statistical differences between the two groups.Conclusion The level of HCV-RNA in the patients with genotype 1 is higher than that with non-genotype1,and the liver damage is severer

HCV； genotype； ALT； AST； PLT

国家重点临床专科建设项目(财社[2010]305号)。

乔斌，男，硕士，主要从事感染性疾病的分子诊断工作。△

，E-mail：liyan@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.002

A

1672-9455(2015)01-0004-02

2014-03-13

2014-08-01)