二恶英暴露对子宫内膜异位症模型形成的影响

崔照领，黄向华，宫心鹏

（1.河北省石家庄市第六医院妇产科，河北 石家庄050091；2.河北医科大学第二医院妇产科，河北 石家庄050000；3.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄050000）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是指子宫内膜腺体或间质出现在子宫以外的部位，具有浸润性。近年来随着环境污染的加重，EMs发病率逐渐增高，但其促发因素尚未阐明。研究表明二恶英与EMs的发病有密切关系，四氯二苯并-p-二恶英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）是环境毒物大家庭中毒性最强的一种，常以微小颗粒存在于大气中，具有生物累积性，可促进EMs的发生及发展，并且随暴露剂量的增高，EMs的发生、发展速度及程度逐渐加重［1］。有研究报道围产期暴露于二恶英可能会促进成年期啮齿类动物患EMs风险［2］。并且胎儿期在二恶英持续暴露的环境下可能促进成年期EMs的发展。本研究旨在探讨发育的不同时期，不同剂量的TCDD对小鼠不同部位EMs的影响。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 成熟雌性无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）级 C57BL／6小鼠60只（体质量18～22g），成熟雄性SPF级C3H小鼠30只（体质量20～24g），均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。2，3，7，8-TCDD为标准品（纯度＞99%，ED-901-C，Cambridge Isotope Labe）。

1.2 实验设计 将C57BL／6雌性小鼠60只与C3H雄性小鼠30只以2∶1随机合笼交配，以见到阴道栓为受孕第0天，在受孕第8天将60只已孕母鼠随机分为对照组（TCDD 0μg／kg）20只和暴露组（TCDD 3μg／kg）40，选择雌性子鼠共60只，在原对照组中选择24只，分为0和3μg TCDD／kg组；在原暴露组中选择36只，分为0，3，10μgTCDD／kg组，每个处理组中12只子鼠，雌性子鼠在生后21d随机分为5个处理组，分别为（生前／生后）：0／0、0／3、3／0、3／3、3／10组（即对照组、青春期＋成年期暴露组、胎儿期＋成年期暴露组、胎儿期＋青春期＋成年期普通剂量暴露组、胎儿期＋青春期＋成年期高剂量暴露组）。在生后49d每个处理组给予3μg／kg TCDD，于第70天给予3μg／kg TCDD，同时行自体子宫内膜移植术，并且于术后3、6、9周各暴露1次TCDD（3μg／kg），术后12周将动物脱臼处死。取其不同部位的种植异位灶，中性福尔马林固定，石蜡包埋用于检查。

1.3 染毒方式 灌胃强饲方法。

1.4 动物建模术 采用自体子宫内膜移植法建立小鼠EMs模型。手术在无菌条件下进行，将一侧子宫角分成3块，分别缝合在小鼠卵巢、腹膜和腹部皮下，每块约2mm×2mm。判断建模成功的标准［3］：①肉眼观，移植的子宫内膜存活，移植物的体积增大，有血管形成，见内含清亮液体的小囊泡；②镜下观，病理检查见囊内有子宫内膜腺体和间质细胞，其间可见大量炎性细胞浸润。

1.5 异位病灶的形成和检测 于建模术后12周处死小鼠，根据大体外观和镜下病理组织形态学鉴定子宫内膜异位病灶的形成，并将异位种植物及其周围粘连的组织取下，制成石蜡块，HE组间染色，用于病理组织形态学的鉴定和评估。

1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠造模成功率比较 各组小鼠于造模术后12周处死，各组均能见到典型的异位病灶（图1）。各组间皮下种植成功率差异无统计学意义（P＞0.05），腹膜和卵巢部位种植成功率差异有统计学意义（P＜0.05）。经过组间两两比较结果显示3／3组种植成功率显著高于0／0组（P＜0.05）。见表1。

0／0组内皮下、腹膜及卵巢异位种植成功率差异无统计学意义（P＞0.05）。0／3组、3／0组、3／3组、3／10组内不同部位的异位种植成功率差异有统计学意义（P＜0.05），0／3组、3／3组、3／10组卵巢的异位种植成功率显著高于皮下（P＜0.05）。3／0组卵巢的异位种植成功率显著高于皮下和腹膜（P＜0.05）。见表1。

2.2 种植成功异位灶肉眼观 随暴露剂量的增加异位灶外观由小囊泡发展为大囊泡，内有大量液体积聚，表面张力较大腹腔组织粘连严重，周围脏器多有炎性充血表现（图2）。

表1 不同组别小鼠子宫内膜异位种植成功情况比较Table 1 The survivor rate of ectopic planations for endometrium among different groups（例数）

图1 小鼠自体子宫内膜移植术后，建模成功的异位病灶组织，见到子宫内膜间质及腺体（HE×400）Figure 1 Endometrial gland and stroma in ectopic tissues successfully established after autotrasplatation of endometrium of mouse（HE×400）

图2 小鼠自体子宫内膜移植术后，建模成功典型的肉眼异位病灶，见大小不等水泡样组织，腹腔粘连严重 （HE×400）Figure 2 Bubbles in the same organization vary in size and synechiaed severely of enterocoeliain successfully established after autotrasplatation of endometrium of mouse（HE×400）

3 讨 论

研究表明EMs的患病率存在种族差异，国家和地区之间发病率明显不同，使人们联想到环境因素可能是促使EMs发病的因素。Eskenazi等［4］对意大利化学物质TCDD意外泄漏事件中受害女性进行的调查发现，接触TCDD浓度越高的女性EMs发病的危险性越大，其患病率与环境TCDD的浓度呈正相关。TCDD可以增加患腹膜型及深部子宫内膜异位结节的风险［5］，并且围产期暴露增加成年期患EMs的风险。本研究通过建立小鼠EMs模型发现，胎儿期＋青春期＋成年期均暴露组的异位种植成功率显著高于对照组，卵巢部位异位灶种植成功率与对照组差异无统计学意义，但其大体外观如腹腔粘连程度较其他处理组明显严重，异位灶的累及范围较其他处理组广泛。说明TCDD可能促进子宫内膜的异位种植，并且高剂量暴露组明显促进子宫内膜异位病灶的种植及生长。

本研究结果显示，TCDD暴露组卵巢部位子宫内膜种植成功率显著高于皮下，而前者为种植于腹腔深部组织，并且3／3组及高剂量组卵巢部位种植成功率明显高于其他组。说明TCDD的持续暴露促进EMs的发生及发展。深部浸润型EMs患者体内脂肪组织中TCDD含量较高［6］，由于TCDD具有生物累积及脂肪聚积性，因此脂肪组织较多的患者是否体内存在EMs的易感性基因，值得我们深思。但本研究中小鼠的子宫内膜组织种植于皮下的成功率较低。是否与皮下脂肪较少有关，尚需进一步研究。

研究表明遗传因素在EMs发病的病因学中起重要作用，环境因素与遗传因素的相互作用具有密切关系［7］。越来越多的证据表明EMs作为一个复杂的特征具有遗传性，多基因遗传易感性产生的显型与环境因子有关［8］。但在有或无EMs妇女的子宫内膜芳香烃受体和二恶英相关基因的表达并没用不同，TCDD的持续性暴露可能会改变基因的高表达［9］。研究发现，TCDD含量高的地区其EMs患病人群比例偏高，上调二恶英相关基因CYP1A1的表达促进EMs的发生及发展［10］。本研究发现小鼠宫内及宫外联合并且持续暴露TCDD，EMs的发生率及严重程度高于其他组，并且高剂量暴露组加重腹腔粘连严重程度。由此推理子宫内膜患病人群是否存在二恶英相关的易感基因，通过某种途径改变子宫内膜的性状，从而使得成年期发病率升高。这也说明为什么不同地区其发病率不同，为我们后续研究提供了新的思路，也为临床寻求有效治疗EMs的方法拓宽视野。

［1］ Heimler I，Rawlins RG，Owen H，et al.Dioxin perturbs，in a dose-and time-dependent fashion，steroid secretion，and induces apoptosis of human luteinized granulosa cells［J］.Endocrinology，1998，139（10）：4373-4379.

［2］ Cummings AM，Hedge JM，Birnbaum LS.Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice［J］.Toxicol Sci，1999，52（1）：45-49.

［3］ Becker CM，Wright RD，Satchi-Fainaro R，et al.A novel noninvasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy［J］.Am J Pathol，2006，168（6）：2074-2084.

［4］ Eskenazi B，Mocarelli P，Warner M，et al.Serum dioxin concent rations and endometriosis：a cohort study in Seveso，Italy［J］.Environ Health Perspect，2002，110（7）：629-634.

［5］ Heilier JF，Nackers F，Verougstraete V，et al.Increased dioxin-like compounds in the serum of women with peritoneal endometriosis and deep endometriotic（adenomyotic）nodules［J］.Fertil Steril，2005，84（2）：305-312.

［6］ Martínez-Zamora MA，Mattioli L，Parera J，et al.Increased levels of dioxin-like substances in adipose tissue in patients with deep infiltrating endometriosis［J］.Hum Reprod，2015，30（5）：1059-1068.

［7］ Bischoff F，Simpson JL.Genetic basis of endometriosis［J］.Ann N Y Acad Sci，2004，1034：284-299.

［8］ Bruner-Tran KL，Yeaman GR，Crispens MA，et al.Dioxin may promote inflammation-related development of endometriosis［J］.Fertil Steril，2008，89（5Suppl）：1287-1298.

［9］ Igarashi T，Osuga U，Tsutsumi O，et al.Expression of Ah receptor and dioxin-related genes in human uterine endometrium in women with or without endometriosis［J］.Endocr J，1999，46（6）：765-772.

［10］ Bulun SE，Zeitoun KM，Kilic G.Expression of dioxin-related transactivating factors and target genes in human eutopic endometrial and endometriotic tissues［J］.Am J Obstet Gynecol，2000，182（4）：767-775.