缓激肽受体及NO在卵巢癌中的表达

陈丽云，郑丽华，罗 飞，苏素文，孙锡红

（1.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北 石家庄050017；2.河北省正定县人民医院妇产科，河北 正定050800；3.河北省正定县疾病控制中心计划免疫科，河北 正定050800；4.河北省石家庄市妇幼保健院妇产科，河北 石家庄050051）

卵巢癌是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一，其中上皮性卵巢癌占卵巢恶性肿瘤的85%～90%，其发病隐匿，早期无症状，发现时往往已是晚期，对于卵巢癌的治疗，传统的化疗方法是紫杉醇＋铂类［1］，但是多数患者停药一段时间后会复发，这可能与卵巢癌的发病机制尚不清楚及肿瘤耐药有关［2］。卵巢癌的发病机制，目前认为与卵巢持续排卵诱发慢性炎症有关。缓激肽（bradykinin，BK）是机体炎症时释放的一种血管活性肽［3］，通过与细胞膜上的Bl和B2受体结合起效［4］。本研究就卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者经手术切除的肿块组织中BK受体亚型及其下游的主要信号分子NO产生的内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达进行比较，希望找到更好的肿瘤靶位，以改善卵巢癌患者的生存质量。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年2月—2012年2月河北省正定县人民医院临床确诊的卵巢癌患者20例，年龄35～58岁，平均（48±3）岁；卵巢良性肿瘤患者20例，年龄30～55岁，平均（47±4）岁；均无高血压、糖尿病等内科疾病及遗传病史。另选择同期健康体检的正常志愿者20例为对照组，年龄30～55岁，平均（46±4）岁。3组年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌组织中B1、B2受体及eEOS、iNOS的表达 卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者（因为正常卵巢组织难以获得，故采用患有良性肿瘤的卵巢组织作为对照），手术后迅速取部分组织用10%甲醛溶液固定24h，常规方法制作蜡块、切片，常规脱蜡、染色、分色、返蓝、复染、脱水、透明、封片。于光学显微镜（×400倍）下观察细胞的颜色变化。以胞浆出现淡黄色至棕色颗粒且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性，否则为阴性。每张切片随机选取5个高倍视野，根据每个视野计数以阳性细胞占同类细胞的比例计算，取平均数，分为4级：①强阳性，阳性细胞比例＞75%；②阳性，阳性细胞比例25%～75%；③弱阳性，阳性细胞比例＜25%；④阴性，表示无阳性细胞。

1.2.2 血清制备及NO含量测定 卵巢癌患者和健康志愿者静脉取血5mL，1 500r／min离心10min，分离血清，血清中NO的含量测定按NO测定试剂盒的测定步骤采用硝酸还原酶法测定其代谢产物的含量，结果以μmol／L表示。

1.3 统计学方法 应用SPSS 10.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织病理学检查 良性卵巢肿瘤患者的卵巢组织内衬单层排列的上皮细胞，类似正常输卵管上皮，细胞无非典型性增生，无结构紊乱。卵巢癌患者的卵巢上皮细胞构成多级的复杂分支状乳头，上皮细胞呈复层、簇状，核分裂像多见，具有非典型的核和高核／浆比。间质内可见成簇或单个瘤细胞浸润（图1）。

2.2 B1及B2受体的表达 免疫组织化学结果显示，良性卵巢组织中B1受体表达呈阴性，B2受体表达呈阳性；卵巢癌组织细胞中B1和B2受体表达均呈强阳性（图2，3）。

2.3 eNOS及iNOS的表达 免疫组织化学结果显示，良性卵巢组织中eNOS表达呈弱阳性，iNOS表达呈阴性；卵巢癌组织细胞中eNOS及iNOS表达均呈强阳性（图4，5）。

2.4 血清中NO含量测定 卵巢癌患者血清中NO含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图6）。

图1 卵巢组织的组织病理（HE×400）A.卵巢良性肿瘤；B.卵巢癌Figure 1 Ovarian tissue pathology（HE×400）

图2 卵巢组织中B1受体的表达（免疫组织化学 ×400）A.卵巢良性肿瘤；B.卵巢癌Figure 2 B1receptor expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

图3 卵巢组织中B2受体的表达（免疫组织化学 ×400）A.卵巢良性肿瘤；B.卵巢癌Figure 3 B2receptor expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

图4 卵巢组织中eNOS的表达（免疫组织化学 ×400）A.卵巢良性肿瘤；B.卵巢癌Figure 4eNOS expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

图5 卵巢组织中iNOS的表达（免疫组织化学 ×400）A.卵巢良性肿瘤；B.卵巢癌Figure 5 iNOS expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

图6 对照组与卵巢癌患者血清NO水平比较＊P＜0.01与对照组比较（t检验）Figure 6 NO content in the blood of ovarian cancer patients and normal controls

3 讨 论

BK是机体一种非常重要的促炎症反应9肽类物质，是激肽释放酶-激肽系统的终末效应物质，其在组织损伤后介导多种炎症和血管反应。BK对机体的作用通过与BK受体（B1和B2受体）结合起效。B1和B2受体均为G蛋白偶联受体。其中B1受体属于诱导型受体，正常情况下几乎不表达，炎症等情况下表达量明显增加，多种因素如生长因子、促炎因子及受体激动剂等均可促使B1受体的表达上调。B2受体在组织中固有表达。BK与其受体结合后可激活多种信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）和核因子 κB 通路［5-7］。其中PKC通道可通过激活细胞内的第二信使（Ca2＋）导致 NO 产生增加［8-9］。

研究发现，卵巢癌、胃癌和肝癌的腹腔渗液中BK水平高［10-13］，提示BK可能参与恶性肿瘤的发生，BK受体有望成为恶性肿瘤的治疗靶位［9］。但目前对其亚型在肿瘤中的表达及各亚型所起的作用研究尚少，且结果也不一致［9，14］。因此，有必要深入研究BK各亚型及其介导的信号传导通路在肿瘤发生及增殖中的作用。该研究有助于更好地了解肿瘤的发生和增殖机制，可为临床更好的联合用药提供实验基础。

本研究结果显示，卵巢癌患者血清中NO含量明显高于对照组，与文献报道的结果一致。NO是近年来在生物体内发现的生物小分子物质，可参与生物体内细胞间的生物信号传递和许多生理、病理过程，特别是NO与肿瘤发生的关系成为近年来的研究热点。在生物体内左旋精氨酸在NOS的作用下与O2结合生成左旋胍氨酸和NO。催化此反应的NOS有3种同功酶：存在于内皮细胞中的eNOS，存在于巨噬细胞、胶质细胞中的iNOS和存在于神经细胞中的神经型NOS。

在内皮细胞中，B2受体的激活导致Gαq／11的活化，进而激活Ca2＋-钙调素依赖性eNOS的激活，使NO瞬时、小量的升高，而B1受体被激活后则可通过G蛋白αi亚单位，G蛋白β、γ亚单位和恶性肿瘤基因依赖性细胞外信号调节激酶／丝裂原活化蛋白激酶的激活导致iNOS的激活［15］。但这一信号通路在卵巢癌的发生发展中是否起作用有待进一步研究证实。本研究以上皮性卵巢癌或卵巢良性肿瘤的卵巢组织为标本，采用免疫组织化学染色方法观察了BK受体的2个亚型（B1和B2受体）及产生其下游信号NO的eNOS和iNOS的表达情况，结果发现卵巢癌组织细胞中B1和B2受体、eNOS和iNOS的表达均增加。提示，卵巢癌患者血清中NO的升高可能与BK激活其受体介导的信号通路（B1受体／eNOS和B2受体／iNOS）有关，但2个亚型所起的确切作用有待进一步研究证实。

肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果，随着人们对肿瘤的深入研究，BK及其受体在肿瘤发生、发展及治疗中的作用将逐渐被阐明。本研究结果显示，BK受体特别是B2受体 在卵巢癌的发生中有非常重要的作用，所以B2受体拮抗剂有望成为卵巢癌治疗的新靶点。

综上所述，卵巢癌患者血清中NO水平明显升高，且卵巢组织中B1和B2受体、eNOS及iNOS的表达都增加。

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