桔全爪螨乙酰胆碱酯酶(AChE)生化特性研究

何恒果，王进军

(1.西华师范大学生命科学学院，西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009) (2.西南大学植物保护学院,昆虫学及害虫控制工程重庆市重点实验室,重庆 400716)



桔全爪螨乙酰胆碱酯酶(AChE)生化特性研究

何恒果1，王进军2

(1.西华师范大学生命科学学院，西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009) (2.西南大学植物保护学院,昆虫学及害虫控制工程重庆市重点实验室,重庆 400716)

为明确桔全爪螨乙酰胆碱酯酶AChE与其抗药性的关系，应用微量滴度酶标板法对桔全爪螨敏感品系(SS)、甲氰菊酯抗性品系(FeR)和阿维菌素抗性品系(AvR)的乙酰胆碱酯酶(AChE)的生化特性进行了比较研究.结果表明：3个品系中，以甲氰菊酯抗性品系FeR的AChE活力、比活力以及最大反应速率Vmax值最大；两抗性品系的AChE活力、比活力和Vmax值均显著高于敏感品系(P<0.05)，且两抗性品系之间也存在显著差异(P<0.05)；米氏常数Km值在3个品系间无显著差异(P>0.05).这说明AChE活力提高是桔全爪螨对甲氰菊酯和阿维菌素产生抗性的原因之一.

桔全爪螨；乙酰胆碱酯酶(AChE)；甲氰菊酯；阿维菌素；抗性

桔全爪螨Panonychuscitri(McGregor)，又称柑橘红蜘蛛,属蜘蛛纲蜱螨目叶螨科,是一种世界性的柑橘害螨，除危害柑橘外，还危害梨、苹果、花椒、苦楝、桂花等多种经济作物和观赏植物[1].由于螨体小、世代多、繁殖速度快、发育历期短等特点，极易对药剂产生抗性.当前，化学防治仍是控制其为害的重要手段之一.但由于不合理用药，桔全爪螨已对许多杀螨剂产生了抗药性[2-6].

乙酰胆碱酯酶，AChE(Acetylcholinesterase,AChE;EC 3.1.1.7)是生物神经传导中一种关键性酶，能够迅速水解兴奋性神经递质—乙酰胆碱(ATC)而使神经突触传导正常进行.AChE的主要作用是催化昆虫(螨)中枢神经系统中胆碱突触中的神经传导物乙酰胆碱的水解，为有机磷类和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标[7,8].在正常情况下，昆虫(螨)神经冲动传导到神经末梢后，立即释放乙酰胆碱，从而引起后突触膜电位的改变，因而效应器官后突触产生兴奋，释放在突触间隙的乙酰胆碱会立即被神经细胞表面的AChE所分解，这样，神经传导会继续进行；如果AChE的活性被有机磷杀虫(螨)剂所抑制，释放在突触间隙的乙酰胆碱则不能被分解，这时昆虫(螨)就会出现中毒症状甚至死亡[7,8].所以，AChE对这些杀虫(螨)剂的敏感性高低与昆虫(螨)对有机磷等杀虫(螨)剂的抗性有着密切的关系.在抗性昆虫(螨)中，AChE活性降低或上升，降低是由于发生了基因突变所致[8]，而升高是其本身未发生改变而只是活性增强[8].

为了明确桔全爪螨抗性的产生与体内AChE的关系，本实验通过微量滴度酶标板法，对桔全爪螨不同品系体内AChE活性及动力学常数进行了比较研究.研究结果为进一步丰富叶螨AChE的研究内容，并为桔全爪螨的综合防治及其抗性治理提供一定的理论指导.

1 材料与方法

1.1 供试螨

供试桔全爪螨采自重庆中国农科院柑桔研究所种质资源圃的枳壳苗上(该苗圃至少10年未用药)，带回室内后移接到盆栽枳壳苗上，在温度为26±1℃，RH为70-75%左右的人工气候室内饲养.种群数量足够后将这一种群分为3个亚种群，其中一个亚种群不用药,视作敏感品系(SS)；另两个亚种群分别用92%甲氰菊酯和93%阿维菌素原药定期用药处理.其中甲氰菊酯抗性品系(FeR)经19代中不连续汰选16次获得，阿维菌素抗性品系(AvR)19代中不连续汰选11次获得.

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂：磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、碳酸氢钠(NaHCO3)、考马斯亮蓝G-250(上海化学试剂公司)、牛血清白蛋白(上海伯奥生物科技有限公司)、碘化硫代乙酰胆碱(ATChI，美国Fluka公司)、5,5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB，美国Fluka公司)、99%毒扁豆碱(美国Sigma公司)、92%甲氰菊酯Fenpropathrin、93%阿维菌素Avermectin原药(成都生物药检所).

主要仪器：酶标仪(奥地利TECAN公司)、Mikro22R型高速冰冻离心机(Whatman Biometra公司)、FA1004A型电子天平(上海精天电子仪器厂)、PHS-4C型酸度计(成都方舟科技开发公司).

1.3 实验方法

1.3.1 生物测定

桔全爪螨生物测定采用FAO推荐的玻片浸渍法[9].为减少因试验个体受药不均匀带来的误差，生测时所选个体均为3-5日龄的健康雌成螨，并且在浸药5s后立即用小块滤纸或吸水纸的边缘迅速吸干附在螨体和粘胶表面的药液.每一浓度设3个重复，另以丙酮水溶液(丙酮<1%)为对照，对照组死亡率在10%以内为有效试验，所得数据在SPSS 12.0 for Windows软件上进行处理，求出毒力回归直线方程和致死中浓度LC50值.

1.3.2 酶源制备

挑取100头雌成螨，用1.2mL 0.1M pH7.0冷冻磷酸缓冲液匀浆，于4℃、10 000g下离心15min，上清液作为酶源.重复3次以上.

1.3.3 蛋白质含量测定

酶源蛋白含量的测定参照Bradford[10]的方法.

1.3.4 乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定

参照Ran[5]、Ren[11]等的方法.用碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)作底物，经AChE水解后生成硫代胆碱和乙酸，与显色剂DTNB生成黄色物质，以毒扁豆碱终止反应，在412nm处测其OD值.连续扫描20min，每1min读一次数，重复3次以上.AChE活性计算参照Ellman[12]方法.

1.3.5 乙酰胆碱酯酶(AChE)动力学常数测定

将1.5mmol/L ATChI分别稀释为0.15、0.3、0.375、0.495、0.6、0.75和1.5mmol/L的浓度，测定方法同活性测定.计算方法参照Wilkinson[13].

2 结果与分析

2.1 生物测定结果

生测结果表明，桔全爪螨对甲氰菊酯的抗性发展迅速，经19代共16次用药筛选，桔全爪螨雌成螨对甲氰菊酯的敏感度(LC50值)由选育前的4.1871mg·L-1提高为选育后的125.2653mg·L-1，抗性增长了29.92倍(表1).而桔全爪螨对生物源农药阿维菌素的抗性发展较为缓慢，经19代共11次喷药的筛选，桔全爪螨雌成螨对阿维菌素的敏感度由选育前的0.0221mg·L-1(LC50值)提高为选育后的0.0839mg·L-1，抗性增长3.80倍(表1).

表1 甲氰菊酯和阿维菌素对桔全爪螨不同品系的毒力

2.2 桔全爪螨不同品系AChE活性比较

桔全爪螨不同品系体内AChE的酶源蛋白含量、活力及比活力测定结果见表2.从表中可以看出，桔全爪螨不同品系体内酶源蛋白含量虽有一定差异，但差异不显著.两个抗性品系的AChE活力和比活力都有提高.其中，两抗性品系FeR和AvR的AChE比活力分别是敏感品系的1.61和1.40倍.说明其AChE活力提高可能是桔全爪螨对甲氰菊酯和阿维菌素产生抗性的原因之一.

表2 桔全爪螨不同品系乙酰胆碱酯酶活性的比较

注：表中同一列数据后面的不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.3 桔全爪螨不同品系AChE动力学常数比较

以ATChI为底物，桔全爪螨两抗性品系AChE的Km值与敏感品系相比无显著差异(见表3)，说明AChE对底物的亲和力没有发生改变.但Vmax与敏感品系的相比都有所增加，且分别为敏感品系的1.59倍和1.25倍，差异达显著水平(P<0.05)(见表3)，说明这两个抗性品系体内AChE对底物的催化能力显著增强.

表3 桔全爪螨不同品系AChE动力学常数的比较

注：表中同一列数据后面的不同字母表示差异显著(P<0.05)

3 结果与讨论

1964年，Smissaert研究发现二斑叶螨(T.urticae)抗有机磷品系胆碱酯酶(Cholinesterase)活性仅为敏感品系的1/3，首次证明了在叶螨抗药性中存在靶标部位敏感性降低的抗性机理[14].以后在昆虫和蜱螨中则陆续有了这方面的相关研究[15-20].已经证实，AChE是多种药剂如有机磷和氨基甲酸酯类的主要靶标酶.在正常的昆虫(蜱螨)中，杀虫(螨)剂使AChE活性降低，神经突触间的传递物质乙酰胆碱的正常释放或接收遭到破坏，打断神经传导，使昆虫(蜱螨)死亡.但在抗性昆虫(螨)中，由于药剂的长期选择作用，突触间的物质传递活动已对药剂的干扰或破坏作用有了很强的适应性，发生了某些改变，甚至完全可以不受药剂的干扰而进行正常的神经传导活动，表现为抗药性[8].害虫(螨)对这类杀虫(螨)剂产生抗药性是由于AChE对药剂的不敏感性造成的，而这种不敏感多表现为昆虫(蜱螨)体内AChE活性的降低，这在许多蜱螨类和昆虫中得到证实，如微小牛蜱(B.microplus)[21]，家蝇(M.domestica)[22]，库蚊(Cx.pipiens)[23]等.另一方面，在某些昆虫(蜱螨)的抗性品系中也有AChE活性增高的现象.如嗜卷书虱(L.bostrychophila)敌敌畏抗性品系和磷化氢抗性品系AChE的比活力高于其敏感品系[11].淡色库蚊(Cx.pipiens)DDVP抗性品系和残杀威抗性品系的AChE比活力高于其敏感品系[23].桃蚜(M.persicae)高效氯氰菊酯抗性品系的AChE比活力高于其敏感品系[15].

有关桔全爪螨AChE的研究还很少.研究发现桔全爪螨体内乙酰胆碱酯酶活性的提高是其对哒螨灵产生抗性的原因之一，也是对齐墩螨素产生抗性的主要原因[19]；桔全爪螨对辛硫磷的抗性也与AChE活性增加有关[20]，不同地区桔全爪螨田间种群体内AChE活性的不同与其对药剂的敏感性差异有一定的相关关系[4].本研究结果表明，桔全爪螨甲氰菊酯和阿维菌素抗性品系AChE活性有一定升高，这与前人研究结果一致[19].何林[17]在研究朱砂叶螨(T.cinnabarinus)抗性机理时却发现，朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系和阿维菌素抗性品系的AChE活力均降低，这与本试验结果不同.这说明，蜱螨对杀虫杀螨剂的抗性机理极其复杂，不同种类的叶螨抗性机理可能存在很大的差异.

本实验结果表明，桔全爪螨不同品系之间的AChE活性具有一定的差异，抗性品系AChE活性高于敏感品系，这说明桔全爪螨AChE活性增强可能与其抗药性产生有关.要进一步确定其相关性，还应该加强其分子毒理学方面的研究.

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Biochemical Characteristics of Acetylcholinesterase (AChE) in the Citrus Red Mite,Panonychus citri McGregor (Acari:Tetranychidae)

HE Heng-guo1,WANG Jin-jun2

(1.College of Life Science,China West Normal University,Sichuan 637009;2.Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering,College of Plant Protection,Southwest University,Chongqing 400716)

In order to clarify the relationship between AChE and resistance ofPanonychuscitri,the biochemical characteristics of AChE from three strains (Susceptible strain,SS;Fenpropathrin resistance strain,FeR;Avermectin resistance strain,AvR) ofP.citriwere studied by microplate reader method.The results showed that,among three strains,the activity per mite and specific activity of AChE,as well as theVmaxvalue were highest in FeR.Compared to SS strain,these values in FeR and AvR were significantly higher (P<0.05),and significant difference was observed between two resistant strains (P<0.05).However,there was no significant difference ofKmvalue among three strains (P>0.05).The above results indicated that increased activity of AChE can play important roles in fenpropathrin and avermectin resistance inP.citri.

Panonychuscitri;AChE;fenpropathrin;avermectin;resistance

1673-5072(2015)01-0012-05

2014-11-04

公益性行业(农业)科研专项经费项目(201103020)；四川省教育厅项目(11ZA293)；西华师范大学博士启动基金(10B029)

何恒果(1978-)，女，四川宜宾人，西华师范大学生命科学学院副教授，博士，主要从事农林害虫综合治理.

S666

A