石菖蒲大孔树脂不同洗脱部位高效液相图谱与抗抑郁效应的关联性研究＊

周雅菲，朱显婷，邓雨晴，周 威

（武汉轻工大学医学技术与护理学院，武汉430023）

石菖蒲药材来源于天南星科植物石菖蒲的根茎，味辛、苦，性温，具有开窍豁痰、醒神益智、化湿开胃的功能；其主要化学成分为挥发油类（主要含单萜、倍半萜、苯丙素等）及苯甲酸类、多糖等［1］。本课题组成员前期研究表明，石菖蒲具有良好的抗抑郁效果［2］。但在现有研究中，石菖蒲的抗抑郁效应集中在化学成分、效应、单个成分的作用等层面，少有石菖蒲成分与抗抑郁效应的关联性研究［3－5］。本次研究是以“抗抑郁成分群”研究为核心，通过AB－8大孔树脂制备石菖蒲不同洗脱部位，建立其高效液相特征图谱，确认图谱特征峰及对应特征峰之间的峰面积数据关系，并以小鼠悬尾、游泳等经典行为学实验为观察项目，探讨石菖蒲的特征化学成分组与抗抑郁效应的相关性。

1 材料与方法

1．1 仪器、药品与试剂 THERMO自动进样高效液相（FINNIGAN SURVEYOR，PDA 检测器）；Milli－Q Integral超纯水一体化智能系统制备（Merck Millipore）；手提式中药粉碎机（型号：DFT－200，江阴市洲元药化机械制造有限公司）；真空泵（型号：金叶SHZ－Ⅲ型，上海亚荣生化仪器厂）；旋转蒸发仪（型号：RE－52AA，上海亚荣生化仪器厂）；超声波振荡器（型号：KH3200DB，江苏昆山禾创超声仪器有限公司）；真空干燥箱（型号：DZF6020，上海齐欣科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（型号：B－260，上海亚荣生化仪器厂）；JY6001型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；1／100S电子秒表。95%乙醇购自武汉点达化工有限公司；色谱试剂甲醇购自Fisher公司；AB－8大孔树脂购自天津波鸿树脂科技有限公司；石菖蒲饮片（批号：20121106）购自武汉市神草中药饮片有限公司，经武汉轻工大学生物制药与工程学院陈平教授鉴定为天南星科植物石菖蒲的干燥根茎，药材标本现存于本实验室。实验用雄性昆明小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK（鄂）2004－0007，体质量为（25±5）g。

1．2 方法

1．2．1 原药材浸膏及不同极性部位制备方法 取石菖蒲原药材粉碎过40目筛，加8倍量75%乙醇，浸泡30min，煮沸60 min，倾出药液，压滤；药渣加入4倍量水，煮沸45min，滤过除渣。合并提取液，减压浓缩并真空干燥制成药材干浸膏，称质量。使用AB－8大孔树脂，将粉碎后的石菖蒲药材干浸膏用适量蒸馏水超声溶解，定容至折算药材量1g／mL，以1倍树脂体积／小时上样，以3倍树脂体积／小时的洗脱速度，先后以3倍体积的水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇等进行洗脱，收集洗脱液，浓缩、减压干燥制成干浸膏，称质量并编为AB－8不同浓度乙醇洗脱部位。根据干浸膏质量与原药材质量比，折算成对应原药材质量。

1．2．2 高效液相实验 供试样品制备实验前取制备的原药材及不同部位干浸膏，精确称质量，使用色谱甲醇溶解，超声10 min后色谱甲醇定容；使用0．45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。色 谱 条 件 色 谱 柱 为 Agilent Eclipse XDB－C18（4．6mm×250．0mm，5μm）柱温30℃，流速为1．0mL／min。采用流速：1．0mL／min，溶剂为甲醇（A）－0．01%甲酸水（B）。经条件筛选，确定洗脱梯度为：5%甲醇60min 100%甲醇，样品进样量固定为10μL，检测波长以全波长（PDA，190～400 nm）。由于其1～5峰面积积分值总和占石菖蒲药材PDA液相峰积分总面积80%以上，确定图谱中峰为石菖蒲特征峰。石菖蒲原药材液相特征图谱见图1。

图1 石菖蒲药材高效液相PDA图谱

日内及日间精密度实验取室温放置的石菖蒲原药材供试液，按方法进行液相试验，日内测定5次，测定各特征峰峰面积Asn，计算Asn平均值及相对标准差（RSD），分析日内精密度。连续测定5d，同法测定各特征峰的峰面积及计算Asn平均值和RSD，分析日间精密度。

石菖蒲药材及AB－8不同洗脱部位特征峰自比较分析取的原药材及AB－8不同洗脱部位的供试样品，按照液相色谱条件进行实验，测定不同样品各特征峰峰面积Asn，不同样本平行测试5次。将不同样本中各特征峰峰面积除以样本对应折算的原药材质量（Asn／m）得到对应值Bin，以计算所得的原药材Bin量值为基准（100%），计算各洗脱部位不同特征峰的Bin值占原药材对应特征峰Bin值的百分比。见图2。

1．3 小鼠用药剂量及分组 根据药典推荐剂量，取10g／d的人用剂量。小白鼠分成对照组、石菖蒲药材组及AB－8不同浓度乙醇洗脱部位组，每组10只，根据所确定用药剂量，灌胃给药。依据《中药药理实验方法》［6］中动物与人体表面积比换算法，将其换算成20g小鼠用石菖蒲药材量为26mg／d。根据药材提取物干浸膏及AB－8不同浓度乙醇洗脱部位干浸膏折算后对应的原药材量，药液按0．1g／mL的原药材浓度进行配置。根据小鼠体质量计算实际给药量，1d分两次灌胃给予。

1．3．1 小鼠悬尾实验（TST） 根据文献［2］，在各组小鼠适应环境1周后，均按剂量要求灌胃给药，每天2次；对照组给予同等体积的蒸馏水。连续给药7d，并于实验第1、3、7天进行TST。在测试当天第2次给药1h后，用胶布将小鼠尾在距尾尖2cm处粘于悬尾平衡支架，勿使小鼠尾部扭曲折叠，使其头部向下悬挂呈倒悬状，头部距离桌面15cm。每只小鼠悬尾6 min，前2min适应，记录后4min内的累计不动时间（不动指小鼠除呼吸外所有肢体均不动）。

1．3．2 小鼠游泳实验（FST） 根据文献［2］，各组小鼠适应环境1周后，均按剂量要求灌胃给药，每天2次；对照组给予同等体积的蒸馏水。连续给药7d，并于实验第1、3、7天进行FST。实验前24h动物进行游泳训练15min，并单笼饲养，禁食不禁水。实验时将当天第2次给药1h后的小鼠单只放入直径约18cm、水深18cm、水温（25±1）℃的圆形容器内，适应2min后开始计算后4min内累计不动时间（漂浮不动状态，仅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶尔划动以保持身体不至沉下）。

1．4 统计学处理 采用SPSS17．0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间采用单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 石菖蒲液相特征峰精密度实验 结果表明日内及日间精密度良好。见表1。

表1 精密度实验

表2 石菖蒲药材及AB－8不同浓度乙醇洗脱部位特征峰峰面积自比较分析

表3 石菖蒲药材及AB－8不同浓度乙醇洗脱部位对小鼠悬尾不动时间、游泳不动时间的影响（x±s）

2．2 石菖蒲药材及AB－8不同浓度乙醇洗脱部位特征峰自比较 结果表明，各特征峰在不同极性部位Bin值占石菖蒲原药材对应Bin值的百分比存在显著差异。1～5号特征峰主要集中于90%乙醇洗脱部位，70%乙醇洗脱部位也有分布。50%乙醇洗脱部位只有特征峰1、2、4的分布，且相对比例低于15%。20%乙醇及水洗脱部位无特征峰分布。见表2。

2．3 TST、FST分析 从给药第1天开始，同测试时间点石菖蒲药材组、90%乙醇组、70%乙醇组与对照组比较，小鼠悬尾不动时间、游泳不动时间明显缩短（P＜0．05）；各组小鼠悬尾不动时间第1、3、7天逐渐缩短；由于小鼠给药量折合原药材量一致，90%乙醇组、70%乙醇组能部分代表石菖蒲药材的抗抑郁功能，而其他部位在药典推荐剂量下几乎无作用。见表3。

3 讨 论

在同石菖蒲药材折算计量的前提下，本次研究所确定的液相特征峰群在石菖蒲药材及AB－8不同浓度乙醇洗脱部位表达有明显差异，其在TST及FST中也表现出了不同效果。石菖蒲、AB－8树脂90%及70%乙醇洗脱部位在药典推荐剂量下有抗抑郁效应，且90%部位强于70%部位。其效应与特征峰具有特征相关性。90%乙醇洗脱部位集中了药材中超过一半质量（峰面积折算）的1～5特征峰对应物质；70%乙醇洗脱部位集中了近1／4质量的1～5特征峰对应物质；而50%、20%乙醇及水的部位无法发现峰3、5对应的峰。结合以上分析可知，1～5号峰群同时出现与石菖蒲的抗抑郁效应具有良好的相关性，其抗抑郁效应与其含量呈正相关；如缺失峰3、5的表达，则在药典剂量下几无抗抑郁效应。证明对1～5号峰群的富集且全表达有利于石菖蒲抗抑郁效应。

中药是一个多种成分的复合体；科学合理的质量控制方法是保证中药质量的前提和基础。现有很多研究运用高效液相等现代设备，建立相应特征图谱来描述及控制中药质量［7－9］。

本次研究依据“成分－效应”相结合的思路，建立石菖蒲抗抑郁有效成分群的高效液相紫外特征谱，为今后的进一步研究及确定中药石菖蒲抗抑郁产品的质量控制方法提供借鉴。

［1］ 黄泰康．常用中药成分与药理手册［M］．北京：中国医药科技出版社，1994：686．

［2］ 谭安娜，周威，包祖晓．“助阳舒心方”及其拆方抗抑郁作用［J］．中国医院药学杂志，2011，31（15）：1317－1318．

［3］ 曾志，叶雪宁，沈妙婷，等．不同产地石菖蒲的挥发性成分研究［J］．分析测试学报，2011，30（4）：407－412．

［4］ 董小萍，邓放．石菖蒲质量标准研究进展［J］．成都中医药大学学报，2001，24（1）：60－62．

［5］ 房敏峰，张文娟，李云峰，等．GC－MS分析药对远志－石菖蒲中的脂溶性成分［J］．药物研究，2009，18（23）：3－5．

［6］ 陈奇．中药药理实验方法［M］．北京：人民卫生出版社，1994：206．

［7］ 戴莹，姜艳艳，刘洋，等．基于类药有效组分特征图谱的中药复方质量表征模式研究［J］．北京中医药大学学报，2011，34（5）：326－331．

［8］ 姜艳艳，戴莹，巴寅颖，等．基于开心散远志类药有效组分特征图谱的远志质量表征研究［J］．北京中医药大学学报，2011，34（8）：544－547．

［9］ 周威，石任兵，孙建宁．清脑宣窍有效组分在正常及不同模型大鼠体内的心脏药动学［J］．中国医院药学杂志，2009，29（17）：1437－1440．