Cx30.2和Cx45在急性心肌梗死大鼠心脏结区组织中的表达

顾国萍 张丽华

[摘要] 目的 探讨急性心肌梗死大鼠心脏结区组织中连接蛋白（Cx30.2、Cx45）的表达。 方法 结扎大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型，随机分为模型组（MI组，n = 10）和假手术组（只穿线不结扎，SH组，n = 10）。术后4周取心脏标本，采用免疫组化和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测心脏结区组织中Cx30.2和Cx45蛋白及mRNA的表达。 结果 术后4周MI组Cx30.2和Cx45蛋白表达增加，分布不均，无规则，与SH组相比，蛋白表达差异有高度统计学意义（P = 0.00）；Cx30.2和Cx45 mRNA在MI组的表达量亦增加，与SH组相比，差异有高度统计学意义（P = 0.00）；Cx30.2和Cx45 mRNA的表达具有明显正相关（r = 0.938，P < 0.05）。 结论 急性心肌梗死后心脏结区组织中Cx30.2和Cx45表达增加，二者mRNA表达呈正相关。

[关键词] 急性心肌梗死；连接蛋白30.2；连接蛋白45；免疫组化；逆转录聚合酶链式反应

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（c）-0022-05

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）因心肌缺血缺氧及缺血-再灌注损伤等可引起包括心律失常、心泵功能衰竭和心脏机械结构破坏等多种并发症，其中，心律失常是影响患者预后和生活质量的重要因素之一，其发生机制尚不明确。国内外大量研究认为，多种机制参与了心律失常的发生及维持，如氧自由基的大量生成、Ca2+超载和细胞内酸性物质堆积等。随着对心律失常研究的深入，目前认为心肌细胞闰盘间缝隙连接的改变和心律失常的发生密切相关，是心律失常发生和维持的物质基础[1-3]。

缝隙连接（gap junction，GJ）介导着相邻细胞间离子、小分子代谢物和信号分子（包括第二信使，如Ca2+、IP3、cAMP、cGMP等）的直接扩散，进而构成相邻细胞间电偶联和代谢偶联的结构基础，使两个相邻细胞的细胞浆能够进行直接交换。缝隙连接由连接蛋白（connexins，Cxs）构成，它的作用是介导相邻细胞间电和生物化学信号的传递，为电兴奋的顺序传播构成细胞间的通路而调控心肌细胞的同步收缩。连接蛋白表达与分布的异常将导致相应传导速度和各向异性传导发生变化，从而形成引起心律失常的环路。在大鼠的基因组中已经确认有20种连接蛋白基因[4]。每种Cxs都有其特定的表达区域，发挥着特异的功能，在心脏结区组织中表达的连接蛋白有Cx30.2和Cx45，发挥房室传导延迟的作用，进而保证心房、心室的同步有序收缩，目前尚未见到在动物模型中二者表达变化的研究。本研究通过急性心肌梗死模型的建立，探讨大鼠心脏结区组织中Cx30.2和Cx45的表达。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

HX-100E小动物呼吸机，成都泰蒙科技有限公司；ASB240U生物信号采集分析系统，成都遨生电子有限公司；兔抗Cx30.2单克隆抗体（编号40-7400），Invitrogen公司；兔抗Cx45单克隆抗体，美国Santa公司；逆转录试剂盒及扩增试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；Cx30.2、Cx45和GAPDH（内参）引物，北京赛百盛基因技术有限公司；基因扩增仪，珠海黑马医学仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂。

1.2 模型制备及动物分组

选择SPF级SD大鼠（郑州大学实验动物中心，合格证号410118），体重200～250 g，随机分为模型组（MI组，n = 10）与假手术组（SH组，n = 10）。MI组：SD大鼠称重后，用10%的水合氯醛溶液以300 mg/kg进行腹腔注射麻醉，将大鼠背部固定在大鼠板上，备皮，消毒，连接多道生理信号采集处理系统，肢体导联根据人体的传统部位安放电极，用针电极刺入四肢皮下，监测心电图（electrocardiogram，ECG）。经口气管插管后接小动物呼吸机，调整呼吸频率为50～60次/min，潮气量为3 mL/min，呼吸比3∶2。于胸骨左缘打开胸腔，破开心包，暴露心脏，以左冠状静脉为标志， 距主动脉根部2～3 mm处用6-0无创伤缝线穿过冠状动脉左前降支（left anterior descending，LAD）并结扎。结扎后远端局部心肌由鲜红色变为暗红色，随后苍白搏动减弱，ECG示Ⅰ、aVL导联J点偏移抬高，ST段抬高作为急性心肌梗死模型成功建立的标志（ECG以标准化方法进行心电参数测量[5]）。检查无出血时间断缝合肋骨层，并抽出胸腔内气体恢复胸腔负压后逐层关胸。待大鼠出现自主呼吸拔出气管插管。术后肌注青霉素40万U/d，连用3 d预防感染。SH组于LAD下只穿线不结扎，余操作同模型组[6]。

1.3 取材

术后4周处死大鼠并迅速取出心脏，在两组大鼠心脏结区垂直于心脏长轴分别切取两块厚度为3～4 mm的心肌组织作为标本，一块放入10%的中性福尔马林溶液中，24 h后常规固定脱水、石蜡包埋，用于制备免疫组化样品；另一块迅速放入液氮中，随后转移至-80℃冰箱用于提取RNA。

1.4 免疫组化法检测大鼠心脏结区组织中Cx30.2和Cx45蛋白表达

免疫组化采用SP法，严格按照试剂盒说明操作，DAB显色。用已知阳性切片做阳性对照，0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测大鼠心脏结区组织中Cx30.2和Cx45 mRNA表达

严格按照试剂盒说明提取RNA后逆转录合成cDNA，进行PCR扩增，将扩增产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳，观察电泳结果并照相。用Quantity One 软件分析Cx30.2和Cx45条带的灰度值，并以Rat GAPDH灰度值为标准校正，确定Cx30.2和Cx45 mRNA表达的相对含量。PCR扩增基因引物序列及扩增条件，见表1。

表1 Cx30.2、Cx45、Rat-GAPDH基因引物序列及扩增条件

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；Cx30.2和Cx45 mRNA表达水平的相关性分析采用Pearson检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠急性心肌梗死模型建立成功的心电图标志

结扎LAD后10 min，ECG监测显示Ⅰ、aVL导联J点偏移抬高，ST段抬高，初步说明大鼠急性心肌梗死动物模型建立成功。术后4周处死大鼠时描记ECG示，相应肢体导联出现病理性Q波，伴R波振幅减低。见图1。

2.2 免疫组化法检测心脏结区组织中Cx30.2和Cx45蛋白表达情况

光镜下见SH组心脏结区组织中Cx30.2和Cx45蛋白有少量表达，为棕黄色规律条带状分布；Cx30.2和Cx45蛋白在MI组表达增加，分布不均，无规则。分析结果显示：与SH组相比，MI组Cx30.2和Cx45蛋白表达的平均光密度增强，差异有高度统计学意义（P = 0.00）。见图2（封三）、表2。

2.3 RT-PCR法检测心脏结区组织中Cx30.2和Cx45 mRNA表达情况

Cx30.2和Cx45 mRNA灰度值的变化趋势是一致的，在急性心肌梗死时表达增加，见图3。分析发现：与SH组相比，MI组Cx30.2和Cx45 mRNA表达的灰度值增加，差异有高度统计学意义（P = 0.00），见表2。Cx30.2和Cx45 mRNA表达相关性分析结果显示：Cx30.2和Cx45 mRNA的表达呈明显正相关（r = 0.938，P < 0.05），回归方程为y=0.833x+0.016。见图4。

1：MI组Cx45；2：SH组Cx45；3：MI组Cx30.2；4：SH组Cx30.2

图3 Cx30.2和Cx45 mRNA表达情况

3 讨论

心脏的正常激动起源于窦房结，沿着特殊传导系统（special conduction system，SCS）传导至心房和心室，最后引起心房肌和心室肌细胞的同步收缩。而缝隙连接介导心肌细胞间电偶联和代谢偶联，为电兴奋的顺序传播构成细胞间的通路进而调控心肌细胞的同步收缩。心脏的正常节律基本上是依赖于通过缝隙连接偶联的心肌细胞。心脏正常节律的紊乱（心律失常）是很多心脏疾病（如急性心肌梗死、心力衰竭等）常见的、严重的甚至是致命的并发症。细胞膜的异常导致动作电位的改变在心律失常的发生中起重要作用，但是目前认为缝隙连接及其构成成分缝隙连接蛋白也起重要作用[7]。AMI后可以发生各种心律失常，包括缓慢性和快速性心律失常，甚至致命性心律失常，因此对AMI后缝隙连接蛋白的研究极为重要。既往对AMI后缝隙连接蛋白的研究集中在AMI后心室肌梗死区及梗死边缘区Cx43及Cx45表达的变化，作为心脏结区组织中主要缝隙连接蛋白的Cx30.2和Cx45的研究主要在基因和细胞水平，尚未见到在动物模型的心脏结区组织中Cx30.2和Cx45表达变化的研究。

激动产生的心肌细胞及传导系统的心肌细胞和心房、心室的收缩细胞在形态学甚至细胞间缝隙连接蛋白的表达分布上都有显著的不同[8-9]。Cx30.2主要表达在大鼠的窦房结和房室结等心脏传导系统中，研究发现，在Hela细胞中其构成的缝隙连接通道的电导性是所有缝隙连接通道中最低的（9pS）。Kreuzberg等[1]研究证实，Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的PQ间期比野生型同窝出生大鼠的PQ间期缩短了25%左右，应用心内电极记录心房、希氏束及心室的电信号结果显示：Cx30.2LacZ/LacZ型大鼠从心房到希氏束的传导速度比Cx30.2+/+型大鼠明显加快，心房和希氏束间期分别为（27.9±5.1）ms与（37.1±4.1）ms，而希氏束到心室的传导速度没有发生改变；另外，通过刺激Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的心房诱导了房颤的发生，揭示Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的房室结传导加快和心室应答率增加，进而表明Cx30.2在减慢房室结冲动传播中发挥作用，且限制从心房传导到心室的最大心搏频率；对心房、心室的同步收缩发挥一定的作用，并在房性心动过速等病理生理情况下阻止快速冲动向心室的传播而发挥保护作用，进而减少血流动力学的恶化。敲除Cx30.2基因的大鼠显示，PQ间期缩短，表明Cx30.2延长房室传导，其缩短房室传导延迟时间是由于缩短AH间期而不是HV间期。通过研究经基因敲除减少Cx30.2表达量的大鼠发现其房室结传导速度加快。窦房结和房室结的细胞特异性表达少量的Cx45，在大鼠还表达有Cx30.2，这些缝隙连接蛋白在体外构成低电导性的缝隙连接通道[10-11]。Cx30.2和Cx45在房室结的偶联相对较少，这在房室结延迟传导中起重要作用，进而保证心室肌细胞的有序收缩。

心脏传导系统组成了心肌细胞间电偶联的特殊通道，该通道协调着整个心脏的冲动传播，它的异常导致各种形式的心律失常[12]。窦房结和房室结是哺乳动物心脏传导系统的重要组成部分，是控制与协调心脏电活动的中心，进而有序地协调着心房和心室的顺序收缩。在窦房结和房室结的心肌细胞表达有Cx30.2和Cx45，这些Cxs在体外构成低电导性的缝隙连接通道，且在房室结的偶联相当较少，这使其发挥房室结延迟传导的作用[11，13]。在房室结缝隙连接蛋白的表达是复杂的，某些区域由不同的缝隙连接蛋白共同表达，如兔子房室结三维结构显示：在结区和移行细胞主要表达Cx45，而在希氏束、结后细胞及结后延伸细胞共同表达Cx45和Cx43[14]。故在窦房结功能失调时，房室结延迟房室冲动传播的作用可以保护心室免受快速心房率（比如房颤）的影响，另外房室结可作为潜在的起搏点控制心室的节律。通过基因敲除Cx30.2大鼠的试验进一步揭示了Cx30.2在心脏的正常房室延迟传导中是必需的[1]。Nikhil等[15]研究发现，Cx30.2和Cx40分别在房室传导的慢传导和快传导中起着关键作用，而Cx45对Cx30.2和Cx40基因双敲除大鼠拥有正常PR间期有重要的调控作用。在转基因大鼠体内，Cx45过表达导致了室性心律失常易感性的增加及细胞间偶联的改变[16]。

本实验结果表明，急性心肌梗死后大鼠心脏结区组织中Cx30.2和Cx45蛋白的表达显著增加，与SH组相比，差异有统计学意义（P = 0.00），且分布紊乱不规律，这可能会影响心脏结区组织中Cx30.2和Cx45的偶联；急性心肌梗死后心脏结区组织中Cx30.2和Cx45 mRNA表达较SH组亦明显增高，且二者的表达变化呈正相关。提示Cx30.2和Cx45表达水平的异常升高可能与急性心肌梗死后易发室性心律失常有关。通过电压膜片钳技术对人类在体及鼠类离体心肌细胞缝隙连接通道电导的影响及转染了Cx45的HeLa细胞的研究证实，抗心律失常肽AAP10及其衍生物ZP123对Cx45产生影响进而发挥抗心律失常作用[17]。故需要对急性心肌梗死后缝隙连接蛋白的表达及改善缝隙连接蛋白表达进行深入的研究。

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（收稿日期：2014-10-28 本文编辑：程 铭）