铁皮石斛组织快繁及移栽培养1)

翟明恬 刘红霞 王亚妮

(北京林业大学，北京，100083) (宁夏大地生态有限公司)

铁皮石斛组织快繁及移栽培养1)

翟明恬 刘红霞 王亚妮

(北京林业大学，北京，100083) (宁夏大地生态有限公司)

为了筛选出铁皮石斛的最佳组织培养培养基、最佳移栽基质、最适菌剂种类和施用方式，选取具有1～2片叶片的铁皮石斛分化苗在3种常用组培培养基上培养，11周后，统计平均株高、茎粗、根长、鲜质量的增长量、平均产生新根数、新孽数；选取相同长势的铁皮石斛组培苗，在2种常用兰科植物培养基质上移栽，将3株优良兰科菌根真菌制成4 g·L-1的单一液体菌剂，对铁皮石斛移栽苗分别进行蘸根、灌根，90 d后，统计成活率、平均鲜质量、株高、茎粗增长量、平均新根数。结果显示：MS+0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液+2.4 g·L-1植物凝胶+30 g·L-1蔗糖培养基上生长的铁皮石斛苗平均株高增长量、平均鲜质量增长量、平均新根数、平均分蘖数极显著大于其他两组处理；移栽于V(珍珠岩)∶V(仙土)∶V(松树皮)∶V(活苔藓)=1∶1∶1∶2基质上的铁皮石斛幼苗除平均新芽数略低于移栽于V(花生壳)∶V(石灰岩)∶V(蛭石)∶V(活苔藓)=1∶1∶1∶2基质上的铁皮石斛幼苗外，其他生长指标均高于后者，其中新根数显著高于后者；施用Dh57菌剂的铁皮石斛幼苗在成活率、平均新根数、生长量方面显著高于施用Do60、Ph03菌剂的铁皮石斛幼苗，在株高、茎粗增长量方面极显著高于另外4组处理；施用Ph03菌剂的铁皮石斛幼苗平均新芽数极显著高于施用Dh57、Do60菌剂的处理组；同一菌剂蘸根处理的幼苗生长指标均高于灌根处理。

铁皮石斛；组织培养基质；移栽基质；菌剂开发

To sift the optimal tissue culture medium, transplantation medium, fungal inoculants and their application method ofDendrobiumofficinale, we chose the seedlings with one or two leaves to transplanted on three commonly used culture medium, and after 11 weeks, we took the statistic of the data of the average increase of plant height, stem diameter, fresh weight, root length, new root number, and new tiller number. The seedlings with the same quality after cultured were selected to be transplanted to two commonly used matrixes, fertilized by three excellent growth-promoting orchids mycorrhizal fungi strains with concentration of 4 g·L-1by dipping the root into hyphae suspensions or irrigation with hyphae suspensions. After 90 d, we calculated the data of survival rate, average fresh weight growth, plant height growth, stem diameter growth, new tiller number. Seedings grew on MS+0.34 g·L-1-KNO3+100 g·L-1potato extract +2.4 g·L-1plant gel+30 g·L-1sucrose medium with higher quality in average increase of plant height, fresh weight growth, new root number, new tiller number, showed a significant difference with the other two. Seedlings transplanted on 1 cm perlite+1 cm soil (a generally used matrix for orchids)+2 cm live moss were superior to those transplanted on peanut (1/3)+shell limestone (1/3)+vermiculite with 0.1 cm diameter(1/3) considering all indexes but the amount of new budlets. Seedlings applying Dh57 inoculants preceded these applying Do60 or Ph03 in survival rate, amount of new root number, average increase of plant height, stem diameter, however, were inferior to these applying Ph03 considering amount of new budlets. Seedlings had an obviously higher quality with the inoculants application mode of dipping rather than irrigation.

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是中国传统名贵中药材，具有除弊，下气，补五脏虚弱羸瘦，强阴，清热，厚肠胃，轻身延年等优良品质[1]，在我国热带和亚热带均有广泛分布[2]。然而，由于人为的大肆采挖和原生境的破坏，野生铁皮石斛已经濒临灭绝。供需关系的严重不平衡，推动了铁皮石斛人工栽培及其产业化的发展。目前，铁皮石斛工厂化生产采用先组织培养成苗，再移栽大棚的方式。

铁皮石斛成苗至少4个月，300多天才能出瓶，需要多次继代培养，这造成污染率的增加，因而生产成本居高不下，对开展大面积人工栽培非常不利[2]。众多学者在基础培养基上添加各种组分，以期缩短培养时间，降低生产成本。研究发现，NAA，BA等植物生长调节物质在铁皮石斛组织培养中起到生根壮苗的作用[3]，马铃薯汁等天然添加物也可以促进铁皮石斛生根和壮苗[4]。

铁皮石斛移栽时基质的透气性与保水性是移栽成活率高的关键，后期生长量是规模化生产成功与否的关键[5]。另外，由于石斛属植物根部没有根毛、只与菌根真菌共生、依靠菌根提供营养，进行大规模组培苗人工移栽时，往往因缺少适宜的共生菌根真菌的参与，导致移栽苗成活率低且生长缓慢，这种状况大大限制了石斛产业的规模化发展[6]，施加菌剂是一个有效的解决方法。

本研究用植物凝胶代替琼脂，进一步比较植物生长调节物质和天然添加物对铁皮石斛组培苗生根壮苗作用的优劣；采用三因素完全随机区组的试验布置移栽铁皮石斛组培苗，探究2种常用兰科植物移栽基质、3种兰科植物菌根真菌制作而成的菌剂及其施用方式对铁皮石斛移栽苗各项生长指标的影响。

1 材料与方法

植株：选择生长一致的铁皮石斛原球茎分化苗。

菌株：实验室分离自野生石斛和兜兰的共生菌根真菌，编号为Do60、Dh57、Ph03(表1)。

表1 供试菌株

试验用品：PDA培养基、燕麦培养基、MS培养基、蔗糖、植物凝胶、NAA、IBA、土豆提取液、KNO3、维生素B；珍珠岩、仙土、松树皮、活苔藓、花生壳、石灰岩、蛭石；深6 cm、宽28 cm、长54 cm的穴盘；酒精；搅拌机。

铁皮石斛生根壮苗培养基筛选：采用以下3种生根壮苗培养基，每种培养基灭菌前pH值为5.8，装于容量为700 mL的组培瓶中，每瓶定量100 mL。

编号1：MS+2.4 g·L-1植物凝胶+30 g·L-1蔗糖。

编号2：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+2.4 g·L-1植物凝胶+30 g·L-1蔗糖。

编号3：MS+0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液+2.4 g·L-1植物凝胶+30 g·L-1蔗糖。

在超净工作台上，用灭菌镊子将具叶1～2片、茎基粗1～2 mm的铁皮石斛原球茎分化丛生苗分成单株后编号，测量每株的鲜质量(g)、株高(cm)、茎粗(mm)并记录。将其垂直移栽到生根壮苗培养基上，每瓶3株苗，每种处理重复20瓶，用灭菌后的保鲜膜和封口膜封口，置于(22±1)℃、光照强度1 600～2 000 lx、光照周期为16 h/8 h的组培室内培养，定期观察，出现污染及时清理。11周后，统计剩余组培物每株的根数(条)、分蘖数(个)，测量其鲜质量(g)、根长(cm)、株高(cm)、茎粗(cm)，并记录。

用Excel 2007和SPASS 20.0进行数据处理和分析。结果用“均值±标准差”表示，显著性差异水平P取0.01和0.05。

铁皮石斛移栽基质、菌剂及施用方式筛选：移栽植株，在壮苗生根后的组培苗中，选择具根2～3条，株高3～4 cm、茎粗2～3 mm且生长一致的植株，置于组培瓶中放置在移栽室进行一周的炼苗。移栽室光照强度为1 500～2 000 lx、相对湿度70%～90%、温度(22±2)℃、光周期16 h/8 h。

移栽基质：在预试验的基础上，设以下2种适合的基质进行对比。

编号1：使用前按V(珍珠岩)∶V(仙土)∶V(松树皮)=1∶1∶1混匀，覆盖活苔藓2 cm。

编号2：使用前按V(花生壳)∶V(石灰岩)∶V(蛭石)=1∶1∶1混匀，覆盖活苔藓2 cm。

菌剂制作：用打孔器(直径0.5 cm)在3种菌株的菌落边缘打取菌块，转接到含燕麦50 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、维生素B110 mg·L-1的液体培养基中(每500 mL容量瓶内装入400 mL液体培养基)，每瓶40块，置于130 rpm的摇床上，25 ℃恒温振荡培养12 d，用搅拌机(转头和搅拌杯高压灭菌)将菌丝体和发酵液一同打碎，制成质量浓度为4 g·L-1的单一液体菌剂。

利用以下2种方式施用菌剂。蘸根，将组培苗在菌剂中浸泡2 h后移栽。对照CK1在无菌水中浸泡相同时间后移栽；灌根，组培苗移栽后，拨开基质在根部浇灌菌剂，每株10 mL，每30 d施加1次。相应对照CK2则浇灌等量无菌水。

移栽前将所有基质用自来水清洗干净，121 ℃灭菌2.5 h，苔藓浸泡于75%酒精中20 min灭菌。穴盘置于30 cm×60 cm的托盘中，所需器皿在使用前在75%的酒精中浸泡20 min。

采用三因素完全随机区组的试验布置，共划分8个区组(8次重复)，每个区组16个小区，分别安排16个处理组合，这16个处理组合如表2所示。

表2 移栽基质、菌液种类、施用方式的处理组合

注：a1表示移栽基质1；a2表示移栽基质2；b1表示Do60菌液；b2表示Dh57菌液；b3表示Ph03菌液；b4表示蒸馏水；c1表示蘸根方式；c2表示灌根方式。

无菌水清洗组培苗根部，用苔藓包裹，露出根基，定殖于穴盘中。16个处理组在穴盘中以随机方式排列，设置8个重复(区组)。定期观察，给托盘中和穴盘中添水，保持苔藓湿润。

移栽前，对每株进行编号并测量记录其株高(cm)、茎粗(mm)、鲜质量(g)。90 d后，统计记录不同移栽基质上苗木成活株数和每株植物的新根数(条)、新芽数(个)，测量其株高(cm)、茎粗(mm)、鲜质量(g)。计算每种处理的成活率、平均新根数、平均新芽数、平均茎粗增长量、平均株高增长量和平均鲜质量增长量。其中，株高以植株根基到最高新芽茎秆为准，用直尺测量；茎粗以植株茎部最粗处为准，用游标卡尺测量；平均株高=∑(单株收获时株高-单株初始株高)/株数；平均茎粗=∑(单株收获时茎粗-单株初始茎粗)/株数；平均鲜质量增长量=∑(单株收获时鲜质量-单株初始鲜质量)/株数。

用Excel 2007和SPSS软件对数据进行处理和分析。结果用“均值±标准差”表示，显著性差异水平P取0.01和0.05。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对铁皮石斛生根壮苗的影响

结合表3和图1A、图1B可以看出，经过11周的培养，3号培养基上的铁皮石斛平均株高、鲜质量增长量、平均根数、分蘖数分别为3.61 cm、2.666 9 g、12.55条、6.20个，极显著高于2号和1号；平均茎粗、根长增长量分别为4.061 mm、2.03 cm,和2号不存在显著差异，极显著大于1号。2号培养基上的铁皮石斛平均株高，茎粗、根长增长量，平均分蘖数分别为2.35 cm、3.619 mm、1.83 cm、4.58个，极显著高于1号培养基；平均鲜质量增长量为1.479 1 g，显著高于1号培养基。铁皮石斛最佳生根壮苗培养基为3号培养基：MS+0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液+2.4 g·L-1植物凝胶+30 g·L-1蔗糖。

表3 不同培养基对铁皮石斛生根壮苗的影响

注：表中数据为组培11周后每种处理的“均值±标准差”；同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，同列不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

A.为11周后收获的铁皮石斛分化苗在组培瓶中的生长情况比较(从左到右依次为3号培养基、2号培养基、1号培养基)；B.为11周后收获的铁皮石斛分化苗的形态比较(从左到右依次为3号培养基、2号培养基、1号培养基)。

图1 11周后收获的铁皮石斛分化苗生长情况及形态比较

2.2 铁皮石斛移栽基质、最适菌剂及施用方式筛选

从表4中可以看出，移栽90 d后，1号基质上的铁皮石斛幼苗除新根数为1.43根，显著多于2号基质外，其他各项指标和2号基质均不存在显著差异。两种移栽基质对铁皮石斛影响差别并不大。

表4 不同基质组合对铁皮石斛组培苗移栽生长的影响

注：表中数据为移栽90 d后每种处理成活植株的“均值±标准差”；同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，同列不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

从表5和图2中可以看出，使用菌剂处理的试验组移栽苗各方面生长指标均高于未使用菌剂的对照组。Dh57菌剂在增加移栽苗成活率，促进移栽苗生根，提高株高、茎粗、生长量方面优于Do60、Ph03的。Ph03菌剂在促进新芽萌发方面优于Dh57、Do60。且同一菌剂蘸根处理生长指标均高于灌根处理。

表5 不同菌株处理对铁皮石斛移栽生长的影响

注：表中数据为移栽接菌90 d后每种处理的“均值±标准差”；同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，同列不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

图2 不同菌株处理的铁皮石斛生长情况

3 结论与讨论

本研究对比了MS培养基添加植物生长调节物质0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA和天然添加物0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液对铁皮石斛生长的影响，两种配方的培养基均有促进铁皮石斛根系发育和生物量积累的效果。但相比之下，添加KNO3和土豆提取液最好，生根壮苗效果与添加植物生长调节物质NAA、IBA达到极显著差异，可广泛用于铁皮石斛的组培生产。另外，铁皮石斛组培苗最终要用于药用，而NAA和IBA均为植物生长调节物质，高质量浓度下对人具有一定的伤害，尚不清楚其分解速度，因此，建议用KNO3和土豆提取液替代。

移栽基质试验的2种基质配料中，树皮和珍珠岩属于通透性强基质，仙土和花生壳属于密闭型基质且具有一定的保肥性、保水性，石灰岩是野生铁皮石斛附生的基质，含有石斛生长所需的Ca元素。结果显示，V(珍珠岩)∶V(仙土)∶V(松树皮)∶V(活苔藓)=1∶1∶1∶2基质对铁皮石斛组培苗的移栽效果在生根方面略优于V(花生壳)∶V(石灰岩)∶V(蛭石)∶V(活苔藓)=1∶1∶1∶2，其他方面并无显著性差别。苔藓被认为是最好的假植基质，有报道介绍在石斛及其他兰科植物栽培过程中应先用苔藓裹根[7]。本研究在移栽过程中也采取了此方法，并保证根系自然舒展，松紧度适宜，但结果证明该方法并不利于铁皮石斛穴盘栽培。浇水后，由于根部被苔藓包裹导致铁皮石斛根部通透性差，长期积水，不利于根呼吸，烂根情况严重，导致本次试验移栽成活率低(试验中期发现该现象，将根部苔藓去掉)。因此，建议在穴盘种植时不用苔藓包根。

采用菌株Dh57(Sebacinavermifera)，Do60(Tulasnellacalospora)，Ph03(Tulasnellacalospora)制作的3种液体菌剂均能很好地促进铁皮石斛组培苗的移栽生长，相比对照达到显著或极显著差异。其中施用Dh57菌剂的移栽苗在平均新根数、株高、茎粗、鲜质量增长量、成活率方面均明显优于施用Ph03和Do60的移栽苗。之前的研究报道证实Sebacinaceae真菌能够促进石斛属种子萌发[8]。铁皮石斛移栽生长显示出良好的促生能力，进一步证实S.vermifera菌株是石斛属植物优良的菌根真菌。Ph03也显示出较强的促生能力，尤其是促生新芽的能力与对照和其他菌株均达到极显著差异，而同样是T.calospora的Do60菌株(无细菌伴生)，结果明显不如前者，这可能与Ph03菌株中含有细菌有关。成年兰科植物菌根内主要栖居着Pseudomonas和Bacillus类的细菌[9]，通过种子接种试验发现，这类细菌能够产生适量的生长素促进种子萌发[10]。进一步研究证明內生细菌在与寄主植物长期的进化发展过程中，彼此形成了相互依存、相互作用的生态学关系。植物内生细菌对改善植物生长环境、促进植物生长发育、增强植物抵抗不良外界环境和病虫害侵袭等方面具有极为广泛的生态学作用[11]。而本课题组在兰科植物菌根真菌分离研究中同样观察到菌根真菌伴生细菌的现象，部分Tulasnella属真菌始终与细菌伴生，伴生情况下的Tulasnella属真菌生长快速；另一部分Tulasnella属真菌不存在细菌伴生现象，相比之下生长非常缓慢。结合本次试验结论可以推测出：伴生细菌在Tulasnella(Epulorhiza)属真菌促进铁皮石斛组培苗移栽生长过程中起到一定作用，其中的机理有待深入研究。

兰科植物与菌根真菌的专一性一直是争论的焦点[12]。普遍认为石斛属植物与其菌根真菌专一性较低[13]，但不同的生长阶段与哪种真菌共生却有明显的倾向[14]。本研究也证实了这一点，即从不同兰科植物上分离得到的3株菌根真菌对铁皮石斛组培苗移栽生长促进效果完全不同，从同属霍山石斛成年植株根中分离的Dh57菌株能明显促进铁皮石斛的成活率、平均新根数、株高、茎粗和鲜质量增长量，从同科兜兰属植物中分离的Ph03能够明显促生铁皮石斛新芽萌发的能力，均与对照达到极显著差异，而分离自铁皮石斛的Do60促生效果却低于两者。铁皮石斛同菌根真菌在科、属、种的水平上专一性较低，但不同的菌根真菌能够促进铁皮石斛生长的作用不同。

研究采用了蘸根和灌根两种接菌处理。张霞[15]认为单一液体菌株的注射、蘸根和菌块接种3种不同方式对铁皮石斛移栽成活的影响不存在显著差异。而本研究从结果看，相同菌株的不同施用方式对铁皮石斛的移栽生长存在显著差异。分析这一现象的主要原因是，蘸根处理菌株能够与铁皮石斛根系充分接触，附带在根系的菌液比浇灌在基质中的菌液更容易侵入根系中，形成菌根结构。在实际操作中，蘸根方式也比灌根方式更方便经济，施用浸泡2h即可，无需刨根浇灌，无需后续追加，在生产实践中具有更大的优势，值得推广。

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Tissue Culture and Transplanting ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo

Zhai Mingtian, Liu Hongxia(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Wang Yani(Ningxia Earth Ecological Limited Company)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(1)：50-53，71.

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; Tissue culture medium; Transplanting matrix; Inoculant development

1) 广西科学研究与技术开发计划主席基金项目(09203-04)。

翟明恬，女，1989年4月生，北京林业大学林学院，硕士研究生。E-mail：zhaimingtian@163.com。

刘红霞，北京林业大学林学院，副教授。E-mail：hxialiu@bjfu.edu.cn。

2014年7月11日。

S723.1

责任编辑：任 俐。