抗风湿类中成药和保健食品中非法添加化学成分的高液相色谱-质谱/质谱法检测

黎雪清 鲁艺 王铁杰 殷果 韩东岐 江坤

广东省深圳市药品检验所深圳药品质量标准研究重点实验室，广东深圳518057

抗风湿类中成药和保健食品中非法添加化学成分的高液相色谱-质谱/质谱法检测

黎雪清 鲁艺 王铁杰 殷果 韩东岐 江坤

广东省深圳市药品检验所深圳药品质量标准研究重点实验室，广东深圳518057

目的建立一种快速检测抗风湿类中成药和保健食品中30种非法添加化学成分的高液相色谱-质谱/质谱法。方法色谱条件:C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-0.1%乙酸溶液为流动相，梯度洗脱，质谱条件:电喷雾离子化正离子检测(ESI+)，全扫描一级质谱、选择离子二级扫描质谱检测方式，扫描范围50～800 aum，对抗风湿类中成药和保健食品中非法添加的化学成分进行快速定性分析。结果根据检测到的化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱信息，并与对照品比较，可作为分析抗风湿类中成药和保健食品中非法添加吗啡、甲氧苄啶、对乙酰氨基酚、罗通定、氨基比林、龙胆苦苷、磺胺甲恶哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、盐酸美沙酮、泼尼松、可的松、异丙安替比林、吡罗昔康、氢化可的松、金诺芬、地塞米松、甲基泼尼松龙、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奥沙普秦、双氯芬酸钠、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30种化学成分的有效手段。在50批供试品中，检测到有10种供试品中含有非法添加的化学成分。结论本方法专属性强、灵敏度高，可作为抗风湿类中成药和保健食品中非法添加化学成分的快速检测方法。

液质联用法;快速检测;抗风湿类;非法添加

我国地理纬度跨度大，高寒、高湿地区多，导致我国具有较高的风湿病发病率［1］。风湿性及类风湿性关节炎以疼痛、麻木、关节活动不灵为主要症状，是一种致残性非常强的疾病［2-3］。基于上述情况，不法商家为牟取暴利，突显产品疗效，在抗风湿类中成药和保健食品中非法添加化学物质［4-5］，使通常起效慢的中药和保健食品似乎具备了速效、高效的优点。在健康产品中非法添加的化学药物，未经试验验证、临床验证和国家相关部门严格审核批准，本身质量安全难以控制保证，而且存在随意性和不确定性。这种非法现象会给社会和消费者带来了严重的，甚至导致死亡的威胁，同时引起了国家相关监管部门的重视。建立完善的检测非法添加化学药物的专属性方法具有重要的现实意义。由于中成药和保健食品添加的化学成分种类繁多、基体复杂，对分析仪器的检测能力要求苛刻，现代质谱技术是目前众多分析化学方法中同时具备了灵敏度高、特异性好、普适性强、高通量等优点的分析方法，可对多组分混合物定性鉴定和分子结构的准确判定［6-8］。

高效液相色谱-离子阱-飞行时间高分辨质谱(LCMS-IT-TOF)在现有各厂家质谱仪不能同时实现多级质谱功能和精确质量测定的行业现状下，实现了离子阱质谱和飞行时间质谱的完美结合，从而实现既可以做多级质谱，又能达到高质量精度的强大功能。充分利用IT-TOF获得的多级质谱数据，在一级质谱发现的候选物的基础上，进一步通过多级质谱的数据对比，确认真正的物质，使成分鉴定更准确，离子信息更丰富。

本研究以国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件“抗风湿类中成药”(批准件编号2009025)［9］为基础，结合市场上新发现的非法添加化学成分情况，采用LCMS-TI-TOF对待测成分进行定性分析，获得高准确度、高分辨率、高灵敏度的多级质谱信息，准确快速验证非法添加的化学成分结构，建立了快速检测抗风湿类中成药和保健食品中吗啡、甲氧苄啶、对乙酰氨基酚、罗通定、氨基比林、龙胆苦苷、磺胺甲嗯哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、盐酸美沙酮、泼尼松、可的松、异丙安替比林、吡罗昔康、氢化可的松、金诺芬、地塞米松、甲基泼尼松龙、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奥沙普秦、双氯芬酸钠、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30种非法添加化学成分的液质联用方法［10-14］，进一步为打击药品和保健食品制假售假工作提供了有效的手段［15］。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LCMS-IT-TOF液质联用仪(日本岛津公司，SIL-20A自动进样器，电喷雾离子源(ESI)，LCMSolution色谱工作站);XS105DU十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司);Milli-Q Academic纯水器(美国MILLIPORE公司);SB25-12DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

氨基比林(批号:100503-200301)、吗啡(批号: 171201-201324，含量99.1%)、甲氧苄啶(批号:10031-200304)、对乙酰氨基酚(批号:100018-200408)、罗通定(批号:100452-200301)、龙胆苦苷(批号:200106)、磺胺甲嗯哇(批号:100025-200904，含量99.8%)、安替比林(批号:100506-200301)、阿司匹林(批号: 100113-201104)、盐酸美沙酮(批号:171243-200602)、泼尼松(批号:100199-201002，含量98.5%)、可的松(批号:101128-201001，含量97.2%)、异丙安替比林(批号:100525-200301)、吡罗昔康(批号:100177-200603，含量99.8%)、氢化可的松(批号:100152-200206)、金诺芬(批号:100272-201202)、地塞米松(批号:100129-200804，含量99.6%)、醋酸曲安奈德(批号:100125-201105，含量97.8%)酮洛芬(批号: 100337-200502)、萘普生(批号:100198-200403)、地西洋(批号:171225-200903，含量99.9%)、醋酸地塞米松(批号:100122-201206)、保泰松(批号:100481-200601，含量99.9%)、奥沙普秦(批号:100353-200301)、双氯芬酸钠(批号:100334-200302)、丙酸倍氯米松(批号:100119-200603)对照品均由中国食品药品检定研究院提供;非那西丁(批号:81105，含量98.5%，德国DR.EHRENSTORFER)、甲基泼尼松龙(批号:20100402，EDQM)、舒林酸(批号:10J345，含量99.8%，USP)、吲哚美辛(批号:01105，含量99.0%，德国DR.EHRENSTORFER);甲醇和乙酸均为色谱纯;水为超纯水(自制)。待测样品均为市售。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

CAPCELLPAKC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)和0.1%乙酸溶液(B)，梯度洗脱:0～5min，40%～50%A;5～25 min，55%～60%A;25～40 min，70%～75%A;40～45 min，90%A。柱温:35℃;样品室温度: 20℃;进样量:10 μL;体积流量:1.0 mL/min(分流比为1∶5)。

2.2 质谱条件

质谱装配电喷雾电离源(ESI);m/z 50～800 amu;喷雾气流:1.5 L/min;曲型脱溶剂管(CDL)温度:200℃;加热板温度:200℃;检测电压:1.65 kV;干燥气(N2)电压:112 kPa;碰撞能量范围:20%～70%;正离子模式检测。扫描方式采用全扫描一级质谱、选择离子二级扫描质谱监测(MS/MS)。

2.3 对照品溶液的配制

取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升中各含吗啡、甲氧苄啶、对乙酰氨基酚、罗通定、氨基比林、龙胆苦苷、磺胺甲恶哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、盐酸美沙酮、泼尼松、可的松、异丙安替比林、吡罗昔康、氢化可的松、金诺芬、地塞米松、甲基泼尼松龙、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奥沙普秦、双氯芬酸钠、吲哚美辛和丙酸倍氯米松0.1 mg的混合对照品贮备液;精密量取上述贮备液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 供试品溶液的配制

取供试品(相当于一次口服剂量)研细，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取上清液适量加甲醇稀释100倍，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.5 质谱特征

取混合对照品溶液，按上述质谱条件检测。部分化学成分不能达到完全分离，但因各待测成分的准分子离子峰不同，通过质谱的高灵敏和高选择测定，不会造成相互间的干扰。记录全扫描一级质谱、选择离子二级质谱信息。30种化学成分的质谱参数见表1。

2.6 样品测定

按“2.4”项下制备供试品溶液，在上述色谱和质谱条件下测定，共测50批样品，其中包括中成药24批，保健食品26批。测得样品呈阳性的结果见表2。部分对照品及供试品的一级及二级质谱图见图1。

3 讨论

3.1 液质联用法优势

中成药和保健食品添加的化药成分种类繁多、基体复杂［16］，采用化学方法或者高效液相色谱法进行检测时，容易出现假阳性结果;通过一级全扫描模式可获得化合物的准分子离子峰，但若遇复杂的基质，同样容易出现假阳性结果，因此需提取该分子离子为母离子进行二级扫描获得碎片信息。本文采用液质联用法，基于LCMS-IF-TOF谱，对待测成分进行定性分析，获得高质量准确度、高分辨率和高灵敏度的多级质谱LCMS-IT-TOF信息，准确快速验证非法添加的化学成分结构。通过比较对照品及供试品的保留时间、一级质谱分子离子峰及二级质谱碎片等信息，对供试品进行结果确证，提高检测的专属性。

3.2 检测模式选择

由于待测成分繁多，为了全面快速验证多种化学成分，利用离子阱(IT)和飞行时间(TOF)技术优势，可以完成MS1的正离子模式和负离子模式的自动切换并扫描，并可以进行MSn的正离子模式和负离子模式的相互之间切换并扫描。尽管相互切换的时间很短，但正离子模式和负离子模式下的高质量准确度仍然是可以确保的。故本研究采用同时对待测成分进行正负离子模式检测，结果发现待测成分中安替比林和非那西丁由于存在酰胺键(-CO-NH)在负离子检测模式(ESI-)下响应较差，且适合负离子检测的成分在正离子模式(ESI+)下响应较好，待测成分均易加氢或者加钠形成正电荷离子峰。因此，本法最终采用ESI+同时检测30种待测成分，大大简化实验操作，提高检验效率。

3.3 测定结果

随着科技的进步，单一化学成分的效果有时没有多种成分的合理组合更有利于调整人的生理功能，更利于改善产品的质量特征。通过测定结果可见，造假分子也会“与时俱进”把化学药品中的组合应用行为转移到中成药、保健食品中，从非法添加单一成分转向非法添加组合成分［15］。本研究发现添加的化学药成分多属于处方药，服用时有严格的适应证、禁忌证，需要在医生指导下才能安全有效使用。患者在不知情的情况下使用，轻则耽误治疗时机，加重治疗成本，重则过量服用药物，引起严重的不良反应，甚至导致死亡。非法添加化学药成分的客观事实已经对公众生命财产安全形成威胁、造成危害。本方法快速、灵敏、准确，有效地同时检测抗风湿类中成药和保健食品非法添加的多种化学成分，为检测和打击非法添加行为提供更全面、更有力的技术支撑，提高监督检验效率。

笔者还运用上述色谱系统建立了一种在45 min内快速筛查吗啡、甲氧苄啶、对乙酰氨基酚吗啡、甲氧苄啶、对乙酰氨基酚、龙胆苦苷、磺胺甲恶哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、泼尼松、异丙安替比林、氢化可的松、金诺芬、地塞米松、甲基泼尼松龙、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奥沙普秦、双氯芬酸钠、吲哚美辛、丙酸倍氯米松等24种抗风湿类化学成分的高效液相色谱-二极管阵列检测器快速筛查方法以便监督检验。

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Rapid determination of chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products by HPLC-MS/MS

LI XueqingLU YiWANG TiejieYIN GuoHAN DongqiJIANG KunShenzhen Institute for Drug ControlShenzhen Key Laboratory of Drug Quality Standard Research，Guangdong Province，Shenzhen518057，China

Objective To establish an HPLC-MS/MS method for rapid determination of 30 chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products.Methods The HPLC chromatographic determination was condcted on C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm).The gradient elution was done with the mixed solution of methanol-0.1%acetic acid.The mass spectrometer condition was as follows:the ionition mode was ESI+，the mode was mass scan and daughter scan with scan range from 50 to 800 aum，and the chemicals in sample were rapid screended and identified.Results Chemicals added illegally，ncluding Morphine，Trimethoprim，Paracetamol，Rotundine，Aminopyrine，Gentiopicroside，Sulfamethoxazole，Phenazone，Aspirin，Phenacetin，Methadone hydrochloride，Prednisone，Cortisone，Propyphenazone，Piroxicam，Hydrocortisone，Auranofin，Dexamethasone，Methylprednisolone，Triamcinolone acetonide acetate，Ketoprofen，Sulindac，Naproxen，Diazepam，Dexamethasone acetate，Phenylbutazone，Oxaprozin，Diclofenac sodium，Indomethacin and Beclomethasone dipropionate，were identified according to the spectrum，chromatogramphic behavior and mass spectral data by comparison with those of reference substances.Chemicals added illegally were detected in 10 samples from 50 samples.Conclusion The method is sufficiently selective，sensitive and can be employed in the rapid determination of chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products.

HPLC-MS/MS；Rapid determination；Anti-rheumatic；Illegally addition

R917

A

1673-7210(2015)02(c)-0086-05

2014-11-25本文编辑:卫柯)

广东省深圳市基础研究项目(编号JCYJ20120618 153944322)。

黎雪清(1987.1-)，女，硕士研究生;研究方向:药物质量分析与标准研究。